实验6 凝胶层析分离技术—血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

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1、实验6、凝胶层析分离技术——血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离(学生实验方案）一、实验目的1.掌握凝胶层析的基本原理。2.熟悉凝胶层析的操作过程。3．掌握蛋白质洗脱分离监测和收集系统的安装及使用技术。二、实验原理凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267KD）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000KD）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进

2、入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。三、试剂配制1、葡聚糖凝胶：sephadexG-252、洗脱液（pH7.2，0.1mol/L磷酸盐缓冲液）：取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml和0.1mol/L磷酸二氢钠280ml，混匀。共配10L。3、0.2%（m/v）血红蛋白溶液4、0.05%（m/v）核黄素(VitB2)溶液5、样品液：0.05%核黄素(VitB2)与0.2%血红蛋白液等量混合置4oC

3、保存。注意：核黄素需近期生产，并新鲜配制。四、主要仪器设备1、恒流泵2、层析柱：高25～40cm，内径1cm。3、自动收集器4、紫外检测仪5、台式记录仪6、可见分光光度计五、实验步骤1、凝胶处理；（1）溶涨与浮选：称取SephadexG-255g，加磷酸盐缓冲液（洗脱液）50ml，置于水中浸泡6小时（沸水浴中为2小时）。转移至100mL量筒中，再加磷酸盐缓冲液（改用蒸馏水）至100mL刻度，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬浮，如此反复多次。（2）平衡：将浸泡后的凝胶，用3~4倍量的洗脱液处理约1小时，搅拌后继续去除上层细浮悬液。2、装柱：取直径0.

4、8～1.2cm长25～30cm的层析柱一支,下端出口接上乳胶管并垂直安好。自柱顶部倒入洗脱液约3-5cm高即行关闭。应避免在柱管和砂芯内出现气泡。将处理好的凝胶在烧杯内用2倍的溶液以细玻璃棒搅成悬液，顺玻璃棒或漏斗自柱顶部沿管壁缓缓加入。待凝胶沉积至2cm时，打开底端出口管，使缓冲液流出，同时继续倒入凝胶悬液，直至凝胶床高度达20cm左右为止,立即关闭下端出口管。注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续,不得有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉。凝胶床表面要保留1cm高的缓冲液。3、平衡：柱装好后，使色谱床稳

5、定5-10分钟，然后接上恒流泵，打开出口用2倍于床体积的洗脱液平衡，使色谱床稳定。流速为0.3ml/min。约1-2h。注意；在洗脱时，要将恒流泵至色谱柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速。另外务必防止流速过大以及过小，造成色谱床液体流干。4、色谱床的检查：新装好的柱要检查其均一性,使用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖2000溶液（0.5ml）过柱,，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱内介质不均一，必须重新装柱。5、加样与洗脱：打开平衡好的色谱柱底部出口，使柱内溶液凹液面与床表面相切时关闭，将吸有0.5ml

6、样品的移液枪在床表面1cm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后，再打开底端出口使样品流至床表面并与床表面相切。用少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面l-2次，然后将洗脱液在柱内约加至2cm高，接上恒流泵并调好流速即开始洗脱{注意：在加样和洗脱过程中防止冲坏床表面)。6、收集与测定：收集时可用自动收集器，流速约为1ml/管/3min。约需收集30管左右。洗脱速度不可过快，以免影响紫外检测仪的灵敏度。紫外检测仪的使用请参照说明书，本实验所用的波长为254nm，灵敏度为0.2A，使用前需预热两小时。台式记录仪的使用请参照说明书。紫外检测仪的检测信号输入台式记录仪，台式记录仪绘

7、制洗脱曲线。本实验所用的量程为10mV，走纸速度为12cm/h。收集后用可见分光光度计在254nm处以洗脱液为空白，对每管收集液进行光吸收测定，测定后以收集管（或mL）为横坐标，吸光度为纵坐标对应作图(该项不做)。测出柱床体积（Vt），外水体积（Vo）内水体积（Vi）(该项不做)。7、实验完成后，用蒸馏水洗脱30分钟，冲洗整套柱体系，然后将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。注意事项：1．在收集过程中，要保持流出液的流速稳定，洗脱速度控制在0.3mL/min。2．加样时，保持凝胶上平面不被搅动。3．液面要始终高于凝胶上平面，否则会导致干柱4．装柱避免出现断层、气泡。