小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因SHP和Cyp7A1的动态改变.doc

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1、小鼠肝脏再生早期胆酸代谢相关基因SHP和Cyp7A1的动态改变【摘要】目的探讨小鼠肝脏70%切除术后再生早期,核受体SHP参与调控Cyp7A1基因表达的机制。方法应用逆转录实时定量PCR检测野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏70%切除术后1h和6hCyp7A1基因和SHP基因的表达。结果2组肝脏Cyp7A1基因表达在术后1h和6h明显降低;SHP基因表达在术后1h显著上升,术后6h急剧下降。结论小鼠肝脏70%切除术后再生早期,非依赖FXR的通路参与胆酸介导的Cyp7A1基因转录的抑制。SHP可通过非FXR介导的途径参与调节Cyp7A1基因的表达。【关键词】肝再生基因表

2、达胆固醇7α羟化酶法尼醇疾病模型动物小异二聚体伴侣(smallheterodimerpartner,SHP)是一种特殊的核受体,它没有DNA结合域,主要表达在肝脏。SHP通过与其他核受体家族成员的相互作用,抑制核受体介导的转录活性[1]。保持胆酸代谢平衡是维持小鼠肝脏正常再生所必需的重要条件[2]。Cyp7A1基因编码经典胆酸合成途径中的限速酶胆固醇7α羟化酶(cholesterol7αhydroxylase,Cyp7A1),其调控主要在转录水平。当核受体法呢醇Ⅹ受体(farnesoidⅩreceptor,FXR)被胆酸激活后,FXR上调SHP的表达,SHP

3、继而与核受体肝脏相关同系物(liverrelatedhomologue,LRH)结合,抑制LRH转录激活Cyp7A1基因的功能[3]。FXRSHPLRH参与的通路是胆酸介导的反馈抑制Cyp7A1基因表达的重要途径。笔者以小鼠肝脏70%切除为动物模型,探讨肝脏再生的急性期,SHP是否通过上述途径参与调控Cyp7A1基因的表达。1材料与方法1.1动物野生型小鼠C57BL/6NCr(美国NationalCancerInstitute),FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠(美国Baylor医学院)。1.2试剂TRI试剂、溴氯丙烷(美国MolecularResearchC

4、enter公司),异丙醇、二乙基焦磷酰胺(美国Sigma公司),MMLV逆转录酶(美国Invitrogen公司),重组核糖核酸酶抑制剂(美国Promega公司),SYBRGreenPCRMasterMix(美国AppliedBiosystems公司)。1.3仪器匀浆器(PTMR2100，美国Lyophiler/polytron公司),低温离心机(CS6R，美国Beckman公司),分光光度计(640B，美国Beckman公司),实时定量PCR系统(7300SYBRGreen，美国AppliedBiosystems公司)。1.4方法1.4.1模型制备野生型小鼠和

5、FXR基因敲除(FXR-/-)小鼠均以C57BL/6NCr为杂交背景。以12∶124h昼夜交替作息。标准鼠类食物喂养,饮水不限。选择8~10周雄性小鼠，每组12只。行70%肝脏切除术小鼠肝脏左外叶、尾叶和中叶完全切除，保持胆囊完整。术后1h、6h分别处死小鼠，收取肝脏,液氮速冻后保存在-80℃冰箱。1.4.2肝脏总RNA抽提和cDNA合成取肝组织100mg,在TRI试剂中匀浆,根据试剂盒方法抽提RNA。取RNA3μg,以OligodT为引物,在反应体系20μL65℃预变性10min后,加入5×FS缓冲液,0.1mol/LDTT,25mmol/LdNTP,Rnasin

6、和MMLV至反应体系30min,42℃1h。1.4.3实时定量PCR应用快速实时定量PCR系统定量检测肝脏中CYP7A1和SHPmRNA表达。使用的正向引物(F)和反向引物(R)包括:CYP7A1(F):CAAGAACCTGTACATGAGGGACCYP7A1(R):CACTTCTTCAGAGGCTGCTTTCSHP(F):GTCTTTCTGGAGCCTTGAGCTGSHP(R):GTAGAGGCCATGAGGAGGATTCβactin作为内对照。1.5统计学处理使用twotailedStudent'sttest进行统计学分析。2结果2.1小鼠肝脏70%切除术后

7、1h和6h,野生型小鼠和FXR/小鼠肝脏Cyp7A1基因表达均明显降低(图1)。A:野生型小鼠;B:FXR-/-小鼠.图170%肝脏切除术后再生早期野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏Cyp7A1基因表达2.2肝脏70%切除术后1h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏SHP基因表达均明显上升(图2)。A:野生型小鼠;B:FXR-/-小鼠.图270%肝脏切除术后1h,野生型小鼠和FXR-/-小鼠肝脏SHP基因表达Fig2SHPgeneexpressionintheliverofwildtypeandFXR-/-miceatonehourafter70%hepatec