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1、RTPCRTPCR-RT-PCR简介 反转录·聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或
2、体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RTPCR-原理 只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RTPCR-过程 RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PC
3、R中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR在一直观众顺次进行。 1、反转录酶的选择两种方法locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame1、Money
4、鼠白血病病毒反转录酶 有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37°。 2、AMV反转录酶 有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适温度为42°。 2、合成cDNA引物的选择 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。一步法 RT-PCR引物的选择： 1.随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。
5、两步法 2.OligodT适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA 和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(Wuzhe
6、nsaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame 3.基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。RTPCR-影响因素 RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度,引物退火的温度，扩增的循环数等。 1、建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。 2、对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产
7、物的得率。 3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。反向PCR·反向PCR反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR-简介PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反转录PCR·locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthe
8、nextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame反转录PCR又称为逆转录PCR，，是指扩增
