两种酵母菌药敏试验的介绍及比较.doc

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1、两种酵母菌药敏试验的介绍及比较【摘要】目的：建立一种简便、实用的酵母菌药敏试验方法。方法：酵母菌纸片扩散法。结果：38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上对氟康唑的平均抑菌圈直径分别为31.32mm和31.26mm，t=0.16，P=0.874>0.05；38株真菌在M44P方案平皿和M27A方案平皿上对沃尔康唑的平均抑菌圈直径分别为33.50mm和33.24mm，t=1.15，P=0.257>0.05。结论：M44P酵母菌纸片扩散法敏感试验方案操作简便、实验结果稳定、可靠。【关键词】酵母菌药敏试验方法酵母菌

2、纸片扩散法比较随着各种抗真菌药物的相继问世和耐药真菌菌株的出现，真菌药物敏感性试验已越来越受到人们的重视，为此美国临床试验室标准化委员会（NCCLS）于2003年介绍了M44P酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了氟康唑（floconazole）和沃尔康唑（voriconazole）质控株的参考范围及氟康唑的抑菌圈解释标准，研究已证实氟康唑对酵母菌的纸片扩散法敏感试验有很好的重复性，可方便、准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性［1～5］。我科同时用M44P方案和M27A方案酵母菌纸片扩散法敏感试验两种方法对36株临床常见酵母菌及2株质控株

3、进行氟康唑和沃尔康唑纸片扩散法敏感试验进行比较。　　1材料与方法　　1.1试验菌株　　36株临床常见酵母菌来源于临床各科送检的痰液、尿液及阴道拭子等标本，用SDA（沙保弱培养基）分离培养，先经科玛嘉显色培养基初步鉴定，后经API20C准确鉴定，其中有白色假丝酵母菌19株，热带假丝酵母菌5株，光滑假丝酵母菌4株，克柔假丝酵母菌3株，近平滑假丝酵母菌3株，季也蒙假丝酵母菌2株；质控菌株：白色假丝酵母菌ATCC900281株和近平滑假丝酵母菌ATCC220191株均为北京协和医院细菌室老师惠赠。　　1.2设备　　(35±1)℃孵育箱，0.5号麦

4、氏标准比浊管（自配方法：取0.5ml0.048mol/LBaCl2(1.175%W/VBaCl2·2H2O)加入99.5ml0.18mol/H2SO4溶液中即可获得0.5号麦氏标准比浊管。　　1.3药敏纸片　　氟康唑25μg/片，沃尔康唑1μg/片。　　1.4M44P方案酵母菌药敏培养基4　　此培养基是在普通细菌药敏试验所用的MH琼脂基础上，经补充2%的葡萄糖和0.5μg/ml的美蓝改良而成。具体制法：500mlMH琼脂中加入50ul美蓝（Methyleneblue）贮存液（0.1g美蓝加入20ml无菌蒸馏水即为美蓝贮存液）和10g

5、葡萄糖，调节pH至7.0，121℃，15min高压灭菌，出锅后在56℃水浴数分钟，在直径为90mm的平皿中倒入25ml，使培养基厚度约为4mm。　　1.5M27A方案酵母菌药敏培养基　　RPMI1640+2%葡萄糖+MOPS+2%Bacto琼脂。具体制法：将Bacto琼脂20g、MOPS40g、葡萄糖20g溶于900ml蒸馏水中，调节pH至7.0，115℃高压15min，出锅后冷却到45℃时加入RPMI1640一袋，混匀即可倾注平皿，在直径为90mm的平皿中倒入25ml，使培养基厚度约为4mm。　　1.6方法　　1.6.1制备浊度为

6、0.5麦氏管浊度的酵母菌悬液　　用接种环挑取数个酵母菌菌落到2ml的无菌生理盐水中使酵母菌悬液的浊度为0.5麦氏管浊度，使酵母菌的菌量约为（1～5）106个/ml。　　1.6.2接种药敏平皿　　用上述制备好的酵母菌悬液浸湿无菌棉签后，让棉签在试管壁上轻轻挤压，挤掉多余的酵母菌悬液，用棉签的侧面而不是顶端从三个不同角度密涂平皿，每个角度相差约60°，最后沿平皿内缘涂沫一周，每株酵母菌接种M44P和M27A方案酵母菌药敏培养基各一块，在涂布细菌的过程中应避免划破平皿上的琼脂，以免影响观察实验结果。　　1.6.3贴药敏纸片　　把接种好酵母菌

7、悬液的药敏平皿放入35℃的孵箱放置约10min（目的是让琼脂充分吸收酵母菌悬液，避免此液体稀释纸片上的药物，导致纸片上药物的扩散速度与酵母菌的生长速度的不协调性），取出后，在每块平皿上贴氟康唑（floconazole）（25μg/片）和沃尔康唑（voriconazole）（1μg/片）各一片，使纸片距离平皿边缘在15mm以上，两纸片间距在30mm以上，轻轻压实，切勿让药敏纸片脱落。　　1.6.4孵育　　让平皿底朝上盖朝下，35℃孵育18h～24h后判读药敏试验结果，如果真24h生长不足，就延长到48h再判读试验结果。　　1.6.5判读结果

8、　　以80%抑制区判读为测量边界，在抑菌圈边缘或内部<240%的少量菌落可忽略不计，测量抑菌圈直径要准确到毫米；NCCLS规定的氟康唑和沃尔康唑对标准菌株抑菌圈直径（mm）的质控允许范围