仿生髓核组织工程支架材料对体外培养髓核细胞合成代谢的影响

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1、第■届脊柱外科学术论坛脊柱脊髓基础文章编号：150仿生髓核组织工程支架材料对体外培养髓核细胞合成代谢的影响李长青，周跃，罗刚，张传志第三军医大学新桥医院骨科【摘要】目的：观测自行设计构建的仿生髓核组织工程支架材料一cIt／HyA—CS(CHCS)支架对体外培养髓核细胞合成代谢的影响。方法：将体外培养的传l代髓核细胞接种于培养瓶内．置人CHCS支架．体外培养10d后，分别测定’H一脯氨酸掺入量、培养液中糖胺聚糖(GAG)含量、髓核细胞可聚蛋白多糖(Aggrman)、核多糖(Decofin)、二聚糖(Big

2、ycan)mRNA表

3、达、Aggrecan蛋白表达等。结果：实验组与对照组的3H一脯氨酸掺入量、培养液中GAG含量、髓核细胞Aggrecan、Decorin、BiglycanmRNA表达、Aggre,ean蛋白表达等均无统计学差异。结论：自行设计构建的髓核组织工程支架材料一CHCS支架对体外培养髓核细胞的合成代谢无抑制作用。腰痛是现代社会中一种仅次于上呼吸道感染的常见病和多发病。是导致劳动力丧失的主要原冈之一。腰椎问盘突出症等椎间盘退行性变是引起腰痛最常见的原冈。研究开发符合椎问盘和／或髓核结构与功能的移植牧，对退变椎问盘进行功能重建，已成为治疗

4、退行性椎问盘疾病比较理想的解决方案。近年来组织工程学技术的迅速发展．为体外构建理想的椎问盘组织创造了有利的条件并提供了可能。采用组织工程学技术构建椎问盘的研究目前国外处于起步阶段．国内尚未见报道。目前文献报道中应用于组织工程化髓核的细胞支架基本来源于骨或软骨组织工程的生物材料。文献中尚未报道髓核组织工程设计构建的专用支架材料。冈此探索构建理想的细胞支架，成为髓核组织工程研究的重点之一。为此。我们设计和构建了仿生髓核组织工程支架材料--CHCS支架．并对其理化性能、免疫原性”I进行了研究。本实验在此基础上．观测了CHCS支架材

5、料对体外培养髓核细胞合成代谢的影响。一、材料与方法(一)髓核细胞的体外分离和培养3W龄乳兔(第i军医大学实验动物中心提供)。取材及髓核细胞的体外分离和培养方法参照本室已建立的方法和培养体系。(二)细胞活力观测单层原代细胞接种前和传代开寸进行台盼蓝染色，按细胞活力=未蓝染细胞数“未蓝染细胞数+蓝染细胞麴计算。(三)髓核细胞的鉴定细胞爬片生长后，以磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，2．5％戊二醛同定，进行II型胶原(Cu)和Aggrecan免疫组化染色。Cn单抗(Chondrex公司生产，工作浓度1：500)／Aggrecan单抗(S

6、anta—Cruz公司生产，工作浓度l：1000)，染色方法参照Chondrex公司Cu染色试剂盒说明书操作。(四)CHCS支架对体外培养髓核细胞合成代谢的影响(1)实验分组：见表l。表1支架对体外培养髓核细胞合成代谢影响研究的实验分组(2)实验步骤：先将已制备的CHCS支架材料．剪成2．0×2．0×1．0Pm大小。气。照射72h消毒后．置入底面积25cm2的培养瓶中。原代培养的髓核细胞达到80％融合后，弃去培养液，加入少量0．25％胰蛋白酶和0．01％EDTA混合液，消化细胞。倒置显微镜下观察．见细胞回缩．问隙增大时。33

7、7第■屑脊柱外科学术论坛脊柱脊髓基础吸除消化液，加入适量含Jf}L清的培养液终止反应．用吸管轻轻吹打瓶壁细胞．使之脱落形成细胞悬液。1000g离心5min，弃上清，培养液漂洗2次后，用DMEM／F12(pH7．0)混悬细胞，计数制成含2×lO‘／ml的细胞悬液。取lmI细胞悬液接种于培养瓶内。然后加人含15％FBS的DMEM／F12(pH7．0)培养液2“，置于37℃、含体积百分数为5％的CO：温箱中培养。培养48h后更换培养液。以后每隔1d更换1次，并收集每次更换的培养液，一20℃保存，备检。每日倒置显微镜观察细胞生长情况

8、及形态变化。传代培养10d。进行光镜观察及代谢指标观测分析。(3)光镜观察：每日倒置显微镜下观察支架内是否有细胞生长及其形态变化。(4)支架材料对髓核细胞合成胶原的影响：髓核细胞新合成的胶原采用’H一脯氨酸掺人法测定。髓核细胞培养的第9d。吸去培养液，加入3ml含有20恤Ci／ml3H一脯氨酸的培养液．继续培养24h，胰酶消化。实验组的支架材料以含lretool／1未标记脯氨酸的0．01mol／lPBS4℃洗涤，加入2mI木瓜蛋白酶缓冲液，55℃消化过夜，离心后与其贴壁细胞合并。两组经消化洗涤后的细胞加入lml0．Oltoo

9、l／1PBS制成细胞悬液。进行细胞计数。将得到的细胞悬液，取500¨l1000rpm离心10min，弃上清?加入60％过氯酸0．1ml、30％H：020．2m1．70～80℃水浴消化至澄清。取o．1ml细胞消化液置于液相闪烁杯中．加入POPPO闪烁液10m1．暗适应8h以上。加样于Beck