SNT2097-2008入出境人员猴痘检验规程.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０９７—２００８入出境人员猴痘检验规程犆狅犱犲狊犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿狅狀犽犲狔狆狅狓犪狋犲狀狋狉狔犲狓犻狋狆狅狉狋２００８０７１７发布２００９０２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２０９７—２００８前言本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国惠州出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人：幸芦琴、李小波、钟玉清、阮力、师永霞、郭波旋、

2、黄吉城、洪烨、相大鹏、郑夔。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０９７—２００８入出境人员猴痘检验规程１范围本标准规定了入出境口岸入出境人员猴痘病毒的实验室检验方法与结果报告，包括样本采集、处理，检验程序、方法，结果判定及报告。本标准适用于入出境口岸猴痘病毒的实验室检验。２术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１猴痘犿狅狀犽犲狔狆狅狓由猴痘病毒（ｍｏｎｋｅｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）引起的人兽共患传染病，临床主要表现有高热、头痛、背痛、全身不适、咳嗽、淋巴结肿大，伴全身出现类似天花的皮疹，偶尔出现腹痛。２．２实时

3、荧光犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚实时荧光ＰＣＲ方法是在常规ＰＣＲ的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，利用犜犪狇酶的５’３’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与ＰＣＲ产物形成完全同步。２．３犆狋值犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定

4、的阈值时所经历的循环数。３仪器和设备需要如下仪器设备。———Ｒｏｃｈｅ荧光定量ＰＣＲ仪；———生物安全柜；———高压灭菌器；———普通冰箱；———普通台式离心机（带密封的离心安全杯）；———冷冻离心机（带密封的离心安全杯）；———研钵；———涡旋器。４试剂１），详见说明书。４．１核酸提取试剂：使用ＴａｋａＲａ基因组ＤＮＡ提取试剂盒１）。４．２ＨｏｔＳｔａｒｔＭｉｘｍａｓｔｅｒ反应试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司１）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这

5、些等效产品。１犛犖／犜２０９７—２００８４．３灭菌双蒸水。４．４实时荧光ＰＣＲ检测的引物和探针Ｆ３ＬＦ５’ＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＡ３’Ｆ３ＬＲ５’ＧＡＣＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴ３’Ｆ３ＬＰＭＧＢ５’ＦＡＭＣＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＴＭＧＢＮＦＱ３’。５样本采集５．１皮疹、痂皮采集：取皮疹上盖或痂皮，装入２ｍＬ的灭菌塑料管里，密封，４℃或４℃以下保存运输。５．２水疱液、脓疱液采集：用附有注射针的一次性注射器吸取０．２ｍＬ的ＰＢＳ，从疱膜插入，来回２次～３次混匀后

6、吸取内容液，把吸取的内容液装入血清管，４℃或４℃以下保存运输。５．３全血采集：静脉采集疑似病人抗凝全血５ｍＬ，４℃或４℃以下保存运输。６样本处理使用ＴａｋａＲａ基因组ＤＮＡ提取试剂盒制备病毒核酸。６．１提取试剂准备（在使用前进行）溶液Ａ、溶液Ｂ若出现沉淀，于６５℃加热溶解，待恢复至室温后使用。６．２病毒核酸提取步骤６．２．１样本制备６．２．１．１皮疹、痂皮等病变组织：取１ｍｇ～１００ｍｇ的病变组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力研成匀浆（富含胶原蛋白的皮肤等组织需加液氮研磨至粉末状）；加入６５０μＬ的溶液Ａ和０．９μＬ的ＲＮａｓ

7、ｅＡ１，温和研磨３０ｓ；收集６５０μＬ研磨好的组织匀浆移至收集管中，如果匀浆不足６５０μＬ，补充溶液Ａ至６５０μＬ，６５℃水浴５ｍｉｎ。６．２．１．２水疱液、脓疱液及病人血液：取２５０μＬ的水疱液、脓疱液及病人全血（含抗凝剂）加入收集管中；加入５００μＬ的溶液Ａ；加入１μＬ的ＲＮａｓｅＡ１，激烈振荡１５ｓ后，冰浴５ｍｉｎ。６．２．２加入４００μＬ的溶液Ｂ，振荡混合。６．２．３加入１ｍＬ的４℃预冷的溶液Ｃ，充分混匀后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。６．２．４弃去上层有机相，再加入１ｍＬ的４℃预冷的溶液Ｃ，充分混匀后，１２００

8、０ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。６．２．５弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于收集管上的滤杯中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。６．２．６弃滤杯，在溶液中加入４００μＬ的ＤＢ缓冲液，混合均匀。６．２．７将试剂盒中的离心柱子安置于收集管上，将上一步的混合溶液转移至离