SNT2532-2010贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５３２—２０１０贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犆狅狓狊犪犮犽犻犲狏犻狉狌狊犲狊犻狀狊犺犲犾犾犳犻狊犺犪狀犱狑犪狋犲狉—犆狅狀狏犲狀狋犻狅狀犪犾犚犜犘犆犚犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法ＳＮ／Ｔ２５３２—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三

2、里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２４千字２０１０年５月第一版２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８６８定价１８．００元标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２５３２—２０１０前言本标准附录Ａ为规范性附录、附录Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李想、杨捷琳、潘良文、黄一、卢钟山、张舒亚

3、、吕蓉、刘月明、高琴、刘代新。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５３２—２０１０贝类和水样中柯萨奇病毒检测方法普通犚犜犘犆犚方法和实时荧光犚犜犘犆犚方法１范围本标准规定了贝类和水样中Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ａ９和Ａ１６型柯萨奇病毒普通ＲＴＰＣＲ方法和实时荧光ＲＴＰＣＲ方法。本标准适用于贝类和水样中Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ａ９和Ａ１６型柯萨奇病毒的定性检测。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使

4、用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求３术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１犆狋值犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。３．２质粒标准分子狆犾犪狊犿犻犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲犿狅犾犲犮狌犾犲一种包含病毒特异性ｃＤＮＡ片段的重组质粒分子，可作为病毒ＰＣＲ检测中的阳性对照。４方法提要用合适的裂解液（如Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ）提取贝类样品中病毒ＲＮＡ，并根据柯萨奇病毒ＲＮＡ３’末端含有Ｐｏｌｙ（Ａ）的结构，用连接Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５的磁珠特异性吸附柯萨奇病

5、毒ＲＮＡ进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒ＲＮＡ。利用普通ＲＴＰＣＲ或实时荧光ＲＴＰＣＲ方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含１拷贝扩增片段），确定分别适于五种血清型柯萨奇病毒检测的普通ＲＴＰＣＲ体系检测下限均为５０拷贝，实时荧光ＲＴＰＣＲ体系检测下限均为２拷贝。５试剂所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。５．１阳性标本：柯萨奇病毒，－８０℃冰箱保存；或含柯萨奇病毒检测目的片段的质粒标准分子，－２０℃冰箱保存。５．２甘氨酸缓冲液：见附录Ａ．１．１。５．３ＰＥＧ８０００溶液：见附录Ａ

6、．１．２。５．４裂解液：Ｔｒｉｒｅａｇｅｎｔ或其他等效裂解液（如：ＴＲＩｚｏｌ）。５．５Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５磁珠：Ｄｙｎａｂｅａｄｓｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５或等效品。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２５３２—２０１０５．６超纯水（无ＲＮａｓｅ和ＤＮａｓｅ污染）：见附录Ａ．２．３。５．７７５％乙醇：见附录Ａ．２．４。５．８三氯甲烷。５．９异丙醇。５．１０１×ＲＮＡ吸附缓冲液：见附录Ａ．２．５。５．１１２×ＲＮＡ吸附缓冲液：见附录Ａ．２．６。５．１２漂洗缓冲液：见附录Ａ．２．７。５．１３ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ，ＴａＫａ

7、Ｒａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲＲ０３７Ｓ。５．１４Ｂｌｅｎｄ犜犪狇ＰｌｕｓＤＮＡ聚合酶及配套缓冲液和ｄＮＴＰｓ，ＴｏＹｏＢｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＴＱ２０１。５．１５ＰｒｅｍｉｘＥｘ犜犪狇ＴＭ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）及配套ＲＯＸ荧光校正试剂（５０×），ＴａＫａＲａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＲＲ０３９Ａ。５．１６引物和探针：根据表１和表２的序列合成引物和探针，引物和探针加超纯水（无ＲＮａｓｅ和ＤＮａｓｅ污染）分别配制成１０μｍｏｌ／Ｌ和５μｍｏｌ／Ｌ储备液。表１柯萨奇病毒普通犚犜犘犆犚检测引物目标名称序列扩增片段大小／ｂｐＣｏｘＢ２Ｆ５’ＹＧＣＶＡＣ