神经酸酿酒酵母细胞菌株的构建

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1、学校代码：10135论文分类号：Q78学号：20154016020研究生类别：全日制硕士学位论文神经酸酿酒酵母细胞菌株的构建ConstructionofNeurogenicAcidSaccharomycesCerevisiaeCellStrain学科门类：理学一级学科：生物学学科、专业：生物化学与分子生物学研究方向：分子生物学申请人姓名：宝日玛指导教师姓名：峥嵘二〇一八年六月一日内蒙古师范大学硕士学位论文中文摘要神经酸是各国公认的世上第一个，也是目前唯一能够修复受损的大脑神经通路（神经纤维），并促使神经细胞再生的双效独特物质，它被广泛应用于医药食品领域

2、。由于目前的神经酸的来源少且成本高，这都严重制约着它的研究与应用，因此开发一种快速、安全高效合成神经酸的方法是十分必要的。本研究首先收集了常见的神经酸含量高的百香果（Passifloraedulia）、油菜（Brassicanapus）和西兰花（Broccolioleracea）3种植物，利用RACE技术，克隆出了它们的β-酮酰辅酶A合酶基因（KCS）。同时构建了含有不同来源β-酮酰辅酶A合酶基因的酵母表达载体，使用电转化的方法，将其表达载体转入了酿酒酵母中，利用G418平板筛选阳性重组菌株，培养48h阳性克隆后，获得了含有不同来源的KCS表达载体的阳

3、性酿酒酵母菌株，并用气相色谱检测了其不饱和脂肪酸含量。研究结果如下：1.利用RT-PCR方法克隆出的百香果、油菜和西兰花3种植物的KCS的保守区片段的长度分别为692bp、693bp和692bp；使用RACE技术获得的百香果、油菜和西兰花3种植物的KCScDNA长度分为1756bp、1886bp和1785bp。2.百香果、油菜和西兰花3种植物的KCS的开放阅读框（ORF）长度均为1521bp，均可编码506个氨基酸的蛋白质，分子量分为56304.90Da、56403.06Da和56410.00Da，等电点分为9.120、9.238和9.230，pH7.

4、0时电荷分为16.945、19.275和19.108。3.利用生物信息学分析软件对百香果、油菜和西兰花3种植物的KCScDNA序列的功能预测表明，这3种植物的KCS蛋白质的三级结构主要由α螺旋和β折叠链组成；预测KCS蛋白质中含有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸3种磷酸化位点；3种植物KCS中均没有发现信号肽。选取12种植物KCS蛋白序列与本研究选的百香果、油菜和西兰花3种植物KCS蛋白序列进行聚类分析。百香果、油菜、西兰花与野萝卜、遏蓝菜、碎米荠、拟南芥、西班牙海和银扇草植物的KCS蛋白归为一大类。基于KCS蛋白油菜和西兰花亲缘关系较近，聚为一类；百香果与野萝

5、卜亲缘关系较近，聚为一类，而与油菜和西内蒙古师范大学硕士学位论文兰花亲缘关系相对远。4.将百香果、油菜和西兰花3种植物的重组质粒在酵母菌株内进行异源表达，筛选出阳性克隆，使用气相色谱对培养48h的阳性克隆进行检测，发现百香果、油菜和西兰花3种植物的KCS能将C18不饱和脂肪酸(C18:1)转化成C24不饱和脂肪酸(C24:1)。本实验用百香果、油菜和西兰花3种植物的KCS成功构建了神经酸酿酒酵母细胞菌株，为酵母工厂大量生产神经酸，奠定了基础。关键词：神经酸，β-酮脂酰-CoA合酶，酿酒酵母，表达载体内蒙古师范大学硕士学位论文ABSTRACTNervon

6、icacidisonekindofmaterialwhichcanimprovenervecellregenerationandplayafunctionalroleinrepairofdamagedneuralcircuitry.Itwaswidelyusedinthefieldofmedicineandfood.Theapplicationandutilizationofnervonicacidwasrestrictedseriously,becauseitsresourcewasfewanditscostwashigh.Itisnecessary

7、todeveloparapid,simpleandsafemethodforsynthetizingnervonicacid.Inthisstudy,wefirstcollectedcommon3kindsofplants(Passifloraedulia,BrassicanapusandBroccolioleracea)withhighlevelsofnervonicacid.Andtheirβ-ketoacyl-CoAsynthasesgenewasclonedbyRACEtechnology.Meanwhile,aSaccharomycescer

8、evisiaeexpressionvectorcontainingtheβ-ketoacyl-