等温滴定量热法在生命科学研究中应用

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1、等温滴定量热法在生命科学研究中应用0等温滴定量热法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有许多独特之处。它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精确度高(本仪器最小可检测热功率2nW，最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围20C-

2、800C，滴定池体积1.43ml)。实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据)。测量时不需要制成透明清澈的溶液,而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。ITC的用途获得生物分子相互作用的完

3、整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43ml，syringe：300μl准备样品体积（最少量）cell：2ml，syringe：5

4、00μl样品浓度cell：几十μM到几mM syringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012M-1滴定实验前恒温30-60min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4hr微量热技术(Microcalorimetry)(2008-05-2719:58:14)标签：杂谈 微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一变化过程的量热曲线，原位(in situ)、在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。微量热法具有

5、以下特点：1.它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。2.样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液。3.量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。4.微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律。微量热法在生物大分子研究中的应用主要有：1.酶促反应2. 蛋白质去折叠/折叠3.抗原-抗体相互作用4.分子伴侣-底物相互作用5.药物-核酸相互作用等温滴定量热法（I

6、sothermal Titration Calorimetry，ITC）实验是通过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每次滴定后，反应热放出或吸收，这些都可以被ITC所检测到。检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数。1  ITC的特点ITC能测量到的热效应最低可达125 nJ，最小可检测热功率2 nW，生物样品最小用量0.4 μg，而且这些年来ITC的灵敏度得到了提高，降低了响应时间（小于10 s）。ITC不需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的。获得物质相互作

7、用完整的热力学数据包括结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）。ITC也比那些选择分析方式（如分析型超速离心法，AUC）快，一个单纯的AUC实验需要几个小时甚至几天去完成，而典型的ITC实验只需30~60分钟，在加上几分钟的响应时间。整个实验有计算机控制，使用者只需输入实验的参数（温度、注射次数、注射量等）计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析ITC得到的数据。其精确度高以及操作简单。 ITC 获取的结果示意图上图：峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 下图：以

8、产生或吸收的总热量为纵坐