荧光定量pcr在临床医学中的应用

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1、荧光定量PCR在临床医学中的应用内容提要一、基因诊断技术简介二、乙型肝炎的病原检测三、丙型肝炎的病原检测四、性病相关病原体的检测基因诊断技术简介4基因诊断3免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录mRNA翻译蛋白质1形态学诊断2生化诊断概念PCR与基因诊断技术基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可

2、在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。荧光染料：SYBRGreenI、EVAGreen荧光探针：TaqMan、HybridizationProbes、Molecul

3、arBeacon荧光定量PCR技术的优点特异性强：直接扩增病原体的特异DNA或异常基因片段灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断取材范围广：血清、痰液、体液、毛发等多种样本全封闭反应：无需PCR后处理，降低污染定量准确：利用标准曲线法，采用对数期分析自动化程度高：操作安全，避免人为判断RocheLightCycler荧光定量PCR技术的临床应用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的基因检测优生优育项目

4、诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等乙型肝炎的病原检测乙肝病毒HBV的感染过程乙肝如何传染？慢性HBV感染病毒持续6个月未被清除者免疫耐受期：HBV复制活跃免疫清除期非活动或低复制期慢性乙型肝炎HBeAg阳性慢性乙型肝炎HBeAg阴性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化代偿期肝硬化失代偿期肝硬化HBsAg与抗HBsHBsAg在感染HBV两周后即可阳性。只要HBsAg阳性就可诊断HBV感染，阴性则

5、不能排除HBV感染。抗HBs为保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力。HBsAg和抗HBs同时阴性：即所谓窗口期，此时HBsAg和抗HBs都未产生。HBsAg和抗HBs同时阳性：HBV感染恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生。或者是亚型感染。为什么HBsAg阴性不能排除HBV感染？窗口期检测试剂不够灵敏隐匿性慢性乙肝（S基因变异）重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）抗HBs阳性就万无一失了吗？单一抗HBs阳性HBVDNA检出率0-11.8%先后感染了不同的HBV亚型HBV病毒S基因变异如何诊断血清HB

6、sAg阴性的HBV感染？提高检测敏感性采用针对变异抗原的检测试剂HBVDNA的检测！HBeAg与抗HBeHBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换。抗HBe阳转后，病毒复制水平低，传染性降低。但长期抗HBe阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示20%～50%仍可检测到HBVDNA，部分可能由于前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。HBeAg与抗HBe共存？处于血清转换过程中野生株与变异株同时存在HBeAg水平与HBVDNA的关系HBeAg阳性标本HB

7、VDNA检出率90％左右HBeAg与HBVDNA有着良好的相关性HBeAg阴性/抗HBe阳性/HBVDNA阳性HBVDNA水平一般较低HBV低水平复制HBV病毒前C区基因变异重叠HCV感染“两对半”缺陷“两对半”是机体的免疫反应状态，为间接指标。“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。HBsAg阴性或HBeAg阴性不能排除HBV感染。HBVDNA是病毒复制和传染性的直接标志。HBVDNA定量对于判断病毒复制程度、传染性大小、病毒药物疗效等有重要意义。HBVDNA拷贝

8、数＝乙肝病毒载量HBVDNA检测的临床意义HBVDNA是HBV存在最直接的依据HBVDNA是HBV复制的标志HBVDNA是患者具有传染性的标志HBVDNA对乙肝两对半起补充作用HBVDNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标HBVDNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎提供直接证据缩短“窗口期”PCR检测“窗口期”核酸检测缩短的“窗口期”的天数HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于献血员窗口