基因治疗2014—医学课件

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1、基因治疗朱平北京大学第一医院一、基因治疗的发展由于人类的大多数疾病与基因的变异有关，随着大量致病的突变基因被发现，基因克隆技术和基因转移手段日益成熟，基因治疗被认为是治愈疾病的最佳方式。尽管真核细胞对抗外源的DNA有很多防御机制，大片密实的异染色质成为天然的屏障，1980年代就有报告提出，病毒可以作为传递基因的工具。1.致病基因的发现包括人类遗传病的突变型基因在内许多基因被确定2.基因克隆技术的成熟上世纪发现反转录病毒的反转录酶。可把任何RNA分子转录成cDNA。3.合适的基因转移手段载体DNA通过改

2、造病毒，磷酸钙沉淀，显微注射法转入到细胞中。我们经过临床观察发现致病基因的例证：原发性血小板增多症转化为急性髓细胞白血病的克隆演变过程（中国实验血液学杂志2012）病例147岁，男，因“发热并全身关节疼痛”1周。几年前曾诊断为原发性血小板增多症，JAK2突变，予以羟基脲、干扰素a-2b等药物治疗。入院时轻度贫血貌，血常规：WBC1.95×109/L，RBC2.46×1012/L，HGB90g/L，PLT251×109/L。骨髓确诊急性髓细胞白血病。对ET患者做单细胞全基因组外显子测序，发现有不同恶性细

3、胞同时存在多种基因突变的时期，其中一个细胞群有明显的生长优势（克隆演化）。82个恶性细胞18个突变的候选基因载体质粒可以插入基因，用克隆技术大量扩增Jenaetal.2013CART2014年被列为世界医学10大进展基因治疗的最佳适应症是X性连锁重症联合免疫缺陷病（X-SCID），是由于IL-2受体家族共用的γ链基因突变导致的。患者淋巴细胞功能受损。最初的临床基因治疗方案是Cavazzana-CalvoM,等在法国巴黎开始的，以一种逆转录病毒（pseudotypedgammaretroviral）为载

4、体。基因治疗使20名中17位患者受益，一半患者T细胞计数达到正常。通过10年的随访，首次接受治疗的患者体内仍有存活的淋巴细胞生长，并且具有广泛的TCR受体。全世界的基因治疗Bubbleboy二、基因载体和基因导入病毒载体Miller设计的逆转录病毒载体是第一个被用于临床试验的载体。载体用包装细胞株扩增，避免病毒产物的重组产生复制能力。加入包装信号，改良滴度，获得更多的载体。逆转录病毒(RV)RNA病毒优点：1）能高效感染宿主细胞2）可整合宿主染色体，随细胞分裂而传代；缺点：1）携带基因容量有限；2）

5、影响插入点附近的基因过度表达或失活3）只感染正在分裂的细胞；腺相关病毒（AAV）需要腺病毒的帮助才可以进行复制。可以转染分裂和非分裂细胞，定点整合于宿主细胞染色体上。微小的病毒颗粒可以逃避宿主的免疫监视，不易引起免疫反应。慢病毒载体（Lentivirus）人类免疫缺陷病毒（HIV）含三个结构基因（gag、pol、env）和六个调控基因（tat、rev、vpr、vpu、nef、vif）。构建重组病毒载体时，仅保留LTR、包装信号和gag部分序列，病毒结构蛋白则由辅助病毒提供。LV可在多种非分裂细胞进行高

6、效的转染和长期稳定的基因表达，包括造血干细胞，以及终末分化的细胞，如神经元，肌肉细胞和肝细胞等。物理方法做基因转移包括磷酸钙共沉淀、显微注射法、微粒轰击法（Particalbombardment）、电穿孔、脂质体法及利用细胞受体介导的基因转移技术。裸基因直接注射整合于载体中的基因可在肌肉细胞中表达长达数星期之久。裸基因技术应用于疫苗，把致病微生物的蛋白质基因整合于质粒载体中，注射机体后会产生蛋白质作为免疫原，诱导机体免疫反应以治疗感染性疾病。基因的电转移基因枪HumanTcells(isolated

7、fromhealthydonor)werenucleofectedwitheGFP(5ug)（李绵洋301医院）Lightandfluorescencemicroscopyanalysis24hourspostnucleofection三、临床开始了基因治疗早在1989NIH核准5位患者输入基因标记的TIL细胞，检测到遗传标记细胞在血液和肿瘤组织出现。这一研究证实了反转录病毒基因转移进行人类基因治疗的可行性和基本的安全性。首例基因治疗1990年Blease,Culver和Anderson治疗腺苷酸脱氨

8、酶（ADA）缺陷病。取4岁女孩患者淋巴细胞将ADA基因体外导入激活的T淋巴细胞，再输回体内，患者免疫功能明显提高。常染色体隐性遗传，严重联合免疫缺陷病。AdA主要在胸腺和其它淋巴组织表达，产物是可催化腺苷酸及脱氧腺苷酸不可逆脱氨反应的酶。AdA在组织中堆积，导致T细胞及相应的B细胞功能障碍。不积极治疗通常在2岁前死于严重的感染。基因治疗的经典－腺苷酸脱氨酶(AdA)缺乏病20％ADA活性已足够避免发病。纠正的少许细胞已可缓解疾病。1、可能进行基因治疗的