高效液相色谱课件

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1、高效液相色谱讲议主讲人：邓湘萍高效液相色谱仪(HPLC)目前常见的HPLC生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。石油醚碳酸钙颗粒色素玻璃柱俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色

2、层法、层析法。色谱分离过程Temporalcourse流动相液相色谱理论发展简况液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。液相色谱理论发展简况它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquid

3、Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。HPLC系统•高压输液系统•进样系统•分离系统•检测系统反相HPLC极性:固定相<流动相固定相-极性

4、弱流动相(甲醇,乙腈等)-极性强极性大物质先出峰正相HPLC极性:固定相>流动相固定相-极性强流动相(己烷,庚烷)-极性弱极性小物质先出峰正相色谱20%反相色谱80%正相色谱20%反相色谱80%主流固定相与流动相色谱柱常用的pH值:为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。检测系统目前有两种基本类型的检测器:专属型检测器只能检测某些组分的某一性质紫外检测器、荧光检测器通

5、用型检测器检测一般物质均具有的性质示差折光检测器、蒸发光散射检测器紫外检测器（UVD）工作原理：基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。优点:a:灵敏度高b:线性范围广C:对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱限制:a:没有紫外吸收的物质不能检测b:应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相原理:光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是

6、时间、光强度和波长的三维谱图。应用a:色谱峰纯度检查b:色谱峰鉴定三维色谱能提供更多全面的信息。二极管阵列检测器(DAD)荧光检测器（FD）原理:物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧光。荧光检测器就是在样品的激发波长处检测发射光的强弱。荧光检测器（FD）优点:a:灵敏度非常高(灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高)，适合于痕量分析b:可以用于梯度洗脱c:对仪器的稳定性（如温度和压力的稳定性）依赖较小d:选择性好，优于紫外缺点:a:适用范围有一定的局限性–只适用于

7、有荧光基团＆衍生化之后有荧光基团的化合物,主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等的检测。b:定量分析时线性范围较窄示差折光检测器（RI）原理：样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。要点：化合物都可用这种检测器检出。灵敏度低，不能用于梯度洗脱。蒸发光散射检测器（ELSD）散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。要点：可用于梯度洗脱分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测,因而主要用于糖类、高分子化合物、高级脂肪酸、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯及甾体类等几十

8、类化合物。谱图分析基本概念和术语色谱图(chromatogram)