实验一-试剂的配制

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1、实验一：LB固体/液体培养基及质粒提取试剂的配制一、实验目的通过本实验，掌握常用LB液体/固体培养基和质粒提取试剂的配制方法和技术，为后续实验做准备二、实验仪器电子天平pH酸度计磁力搅拌器TOMYSS-325/245自动蒸汽灭菌锅电子天平FA/JA系列称量范围：0～200g读数精度：0.1mg（FA2004）1mg（JA2003）称盘直径：80mm（FA2004）110mm（JA2003）预热时间：120min（FA2004）60min（JA2003）将天平置于稳定的工作台上，避免振动、阳光照射和气流使用前观察水平仪，使水泡位于水平仪中心接通电源，开始通电工作（显示器未工作），通

2、常需预热后方可开启显示器，进行操作使用ON开启显示器键/OFF关闭显示器键/TAR清零、去皮键pH酸度计210A酸度计标准配置：210A主机1台，9V电池1块，910600pH电极1支，pH4.01缓冲液，pH7.00缓冲液，pH10.01缓冲液Mode键用来改变模式：MEASURE－CALIBRATE－SETUP用蒸馏水冲洗电极，用纸巾把电极附着的水分吸干，然后将电极插入第1点缓冲液（pH7.00），均匀搅拌缓冲液按mode键至屏幕上部显示CALIBRATE，屏幕下部出现7－4，表示用7.00和4.01的缓冲液校正，按no键可以选择7－10/SET/7/7－4当屏幕下部显示7－

3、4或7－10时，压yes键确认屏幕出现P1，当屏幕出现ready时，第1点校正完成，压yes键确认，仪器进入准备第2点校正，屏幕出现P2将电极从第1点缓冲液中取出，蒸馏水清洗并用纸巾吸干后，将电极插入第2点缓冲液，均匀搅拌缓冲液，当屏幕出现ready时，第2点校正完成，压yes键确认，屏幕显示电极2点校正后的斜率值，仪器自动回到测量状态将电极取出，蒸馏水清洗并用纸巾吸干后，即可测量样品溶液磁力搅拌器（配搅拌子）TOMYSS-325/245自动蒸汽灭菌锅检查排放蒸汽的水壶，使腔体内的水位与托板齐平SET键设置温度和时间（121℃，20min）关闭排气阀，Start机器开始运行，Ch

4、eckHeat检查设置的温度，Stop键终止机器运行程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子腔体内经常清洁LB液体培养基25ml/2瓶+50mL/3瓶LB固体培养基（150ml/2瓶）——每150ml液体培养基中加2.25g琼脂溶液Ⅰ（pH8.0，100ml）0.4mol/LNaOH（100ml）2％SDS（100ml）溶液Ⅲ（pH4.8，100ml）70％乙醇（100ml）50×TAE（200ml）溶液Ⅱ三、试剂配方及配制的操作步骤76，79页（1）LB液体培养基将胰蛋白胨（typtone）10g酵母提取物（y

5、eastextract）5g氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。（2）固体LB培养基：每升LB培养基中加15g琼脂1.LB液体/固体培养基（76页）2.氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置－20℃冰箱保存。3溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)称量→溶解→调节pH值→定容→灭菌4溶液Ⅱ0.4mol/LNaOH2%SDS用前等体积混合。称量→溶解→定容5溶液Ⅲ(pH4.8)

6、5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL79页670%乙醇：放置于－20℃冰箱保存，用后即放回。7胰RNA酶将RNA酶溶于10mmol/LTris·HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/mL浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。8平衡酚(pH8.0)(购于申能博彩公司)9.50×TAE（500mL）121gTris碱28.55mL冰乙酸50mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)四、试剂灭菌LB液体/固体培养基溶液Ⅰ50×TAE实验课20人每班试剂配制时：25mLLB液体培养基/100mL锥形瓶，4瓶/10人

7、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，1套/10人50×TAE，500mL/30人实验分组五、思考题分子生物学实验中，为什么要对器具和耗材等进行清洗和高温湿热灭菌？如果不灭菌，可能会对实验产生怎样的影响？怎样配制LB液体/固体培养基？用碱裂解法提取质粒，在配制溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ时，为什么要使用pH酸度计调节三种溶液的pH值？TOMY灭菌锅的使用注意点有哪些？