免疫学检测技术课件

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1、第十四章免疫学检测技术经典的免疫学方法：一、凝集反应（agglutination）细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块的反应。1、直接凝集反应2、间接凝集反应3、间接凝集抑制反应二、沉淀反应（precipitation）血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。1、单向免疫扩散（singleimmunodiffusion）2、双向免疫扩散（doubleimmunodiffusion）3、免疫电泳（immunoelectrophoresis）4、火箭免疫电泳（rock

2、etimmunoelectrophoresis）5、免疫浊度测定（immunonephelometry）免疫浊度测定：可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出现浊度。透射比浊法散射比浊法速率散射比浊法终点散射比浊法一定要保持抗体过量，以维持抗原－抗体复合物的相对不溶解性。该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物浓度等。第一节免疫学检测常用标记技术免疫标记技术（immunolabellingte

3、chnique）指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质（胶体金、铁蛋白）作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原—抗体反应。优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的Ag/Ab免疫测定：定量检测液体标本中的Ag/Ab也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。一、酶免疫技术基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本中的抗原/抗体进行定量、定位分析。

4、标记物：酶（催化底物：生物放大作用）特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。（一）常用的酶和酶作用底物1、辣根过氧化物酶（HRP）HRP来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶（糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。HRP常用的底物有：（1）邻苯二胺（OPD）OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致癌性，显色反应需避光。（2）四甲基联苯胺（TMB）TMB经酶作用

5、呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最广泛。但水溶性差。2、碱性磷酸酶（AP）AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。AP价格较HRP高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一段时间（405nm）。（二）酶免疫技术的分类酶免疫组化（EIH）均相酶免疫测定（HEI）酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定（EIA）液相酶免疫测定（同RIA）（三）酶免疫测定（EIA）1、均相

6、酶免疫测定（HEI）特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，整个检测过程都在均匀的液相中进行。以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：2、非均相酶免疫测定（1）液相酶免疫测定（液相EIA）：同RIA：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应达到平衡，再加分离剂。（2）固相酶免疫测定（固相EIA）：AgAb反应在固相载体的表面进行，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay——ELISA）1）ELISA基本原理将抗原或抗体结合到固相

7、载体的表面，并保持其免疫活性。抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分别保持其免疫活性和酶活性。在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待测物质含量呈相关性。2）固相载体的种类A、塑料制品聚苯乙烯：蛋白质非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式专用于ELISA的微量反应板——ELISA板（812=96孔）B、微颗粒高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均

8、匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。C、膜载体NC膜（硝酸纤维素膜）、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应用于斑点-ELISA等。3）ELISA方法类型及反应原理A、双抗体夹心法此法是检测大分子抗原的常用方法。上述方法亦可改为双位点一步