硫酸铍对小鼠体外脾淋巴细胞dna损伤的剂量效应

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1、硫酸铍对小鼠体外脾淋巴细胞DNA损伤的剂量效应【摘要】目的：观察不同剂量硫酸铍（BeSO4）在不同时相处理后引发小鼠体外脾淋巴细胞的DNA链断裂损伤的剂量效应.方法：采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定BALB/c小鼠脾淋巴细胞体外染毒0.2,2,20,100和200μmol/L1h和2h后DNA链断裂损伤情况.结果：在不同剂量硫酸铍染毒1h后,脾淋巴细胞出现DNA链断裂损伤的测定指标在各剂量组明显高于对照;染毒1h和2h后,细胞均出现明显的DNA链断裂损伤，但其相同剂量组之间差异无显著性.结论：硫酸铍可诱发小鼠体外脾淋巴细胞的DNA链断裂损

2、伤.【关键词】硫酸铍　　0引言　　铍（Beryllium）及其化合物具有众多优良的理化性质，被广泛应用于高科技工业领域.国际癌症研究中心（IARC）最新公布的对人致癌性总评价表中已将铍及其化合物列为人类肯定致癌物〔1〕.已知铍及其化合物可损害机体的免疫系统〔2-4〕.因此,应用单细胞凝胶电泳（SCGE）法检测，以判断硫酸铍导致脾淋巴细胞功能异常是否由于DNA断裂损伤所致,对于探讨铍免疫毒性作用机制具有重要意义.　　1材料和方法　　1.1材料BALB/c小鼠,雄性，体质量(20±2)g,6～8aAldrich公司);胎牛血清(Hyclone公司)

3、;RPMI1640(Gibco公司);低熔点琼脂糖(Sigma公司);正常熔点琼脂糖(Sigma公司);肌氨酸钠(Promega公司);TrisBase(NOVEN公司);碘化丙锭（PI,Sigma公司);二甲基亚砜（DMSO,北京化工厂);TritonX100(Sigma公司);甲醛(北京化工厂)；EDTA(天津化学试剂厂);全磨沙载玻片；恒温水浴箱(北京医疗设备厂);荧光显微镜(CKX41,Olympus);稳压稳流电泳仪(BIORAD;水平式凝胶电泳槽(DYYⅢ33A型,北京六一仪器厂).　　1.2方法　　1.2.1脾淋巴细胞悬液的制

4、备常规无菌取脾,用注射器内芯加Hanks(pH7.4,4℃)研磨,200目筛网过滤,用RPMI1640完全培养液将其稀释成1×108个/L细胞悬液〔5〕.　　1.2.2细胞染毒分别取脾淋巴细胞6份于试管中,1管加完全培养基作阴性对照,其余5管各加入不同浓度的BeSO4溶液,使终浓度分别为0.2,2.0,20.0,100.0,200.0μmol/L,置37℃恒温水浴振荡器孵育1h;同样设6管同上染毒2h后检测.染毒完毕后用台盼蓝染色观察染毒后的细胞存活率大于90%.　　1.2.3DNA链损伤的检测参照Singh法〔6〕,①制片：分别取125mg低

5、溶点琼脂糖（LMA）和正常溶点琼脂糖（NMA）溶于25mL无Ca2+,Mg2+磷酸缓冲液（PBS）中，制备成5g/LLMA和5g/LNMA.在56℃下，将100μL5g/LNMA浇注到全磨砂载玻片上，盖上盖玻片置4℃，10min使琼脂糖固化.在37℃下，将50μL细胞悬液与50μL10g/L新鲜配制的LMA混匀，4℃固化；再取75mL5g/LLMA铺至第二层琼脂糖上，置4℃，10min固化;②裂解、解旋、中和：将载玻片浸入4℃冷裂解液（2.5mol/LNaCl;100mmol/LEDTA;10mmol/LTris）中裂解1h，电泳缓冲液中避光放置

6、20min；25V，300mA电泳20min，TrisHCl（pH7.5）中和3次，用50μL5mg/L碘化丙锭（PI）溶液染色;③分析：荧光显微镜下使用590nm的绿色激发光进行观察，数码相机拍照，每份样本随机拍摄50个DNA受损细胞，将拍摄的图像输入计算机（图像设置为300×400象素进行分析），运用CASP软件计算彗星细胞的尾长、尾矩、Olive尾矩及尾部DNA百分含量.　　　　统计学处理：用SPSS11.5统计软件包进行方差分析.　　2结果　　2．1染毒后DNA损伤的“彗星”形态学观察染色后在荧光显微镜察20倍镜下观察可见,阴性对照组的

7、淋巴细胞大小比较均一，为一圆形荧光团，荧光强度均匀，边缘光滑，即彗星头部，无拖尾现象（图1A）.BeSO4染毒作用时,损伤细胞的DNA迁移表现为彗星头部核心致密、周边松散,呈刷状缘样；并且随着BeSO4剂量的增加，彗星的尾巴加长，尾部的荧光强度增强，彗星头部的直径随着尾部的加长而减小（图1B,C,D,E,F）.A：阴性对照组；B：0.2μmol/L组；C：2μmol/L组；D：20μmol/L组；E：100μmol/L组；F：200μmol/L组.　　图1硫酸铍致小鼠脾淋巴细胞DNA受损形态　略　　2.2染毒不同剂量DNA链损伤的检测BeSO4染

8、毒1h和2h时所致DNA链损伤出现的尾长及尾矩与对照组相比,各剂量组显著增加(P0.01)，彗星尾部DNA百分含量随着BeSO4剂量的增