昆虫病原线虫共生菌毒素对水稻恶苗病菌的抑菌活性

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1、昆虫病原线虫共生菌毒素对水稻恶苗病菌的抑菌活性崔安妮１，２，姜鑫１，２，郑毅帆１，２，王欢１，２（１．沈阳工学院辽宁抚顺１１３１２２；２．沈阳农业大学沈阳１１０８６６）摘要：利用从全国采集的土样中收集到的２８个品系的昆虫病原线虫，分离并筛选出２８株高毒力共生菌株，对高毒力菌株的毒素进行初步提取，利用水稻恶苗病菌进行抑菌活性测定，结果表明，共生菌ＮＣ３４－３Ｂ的毒素对水稻恶苗病菌抑菌活性最高，抑菌圈半径为１７．５０ｍｍ。.jyqkail__"href="/cdn-cgi/l/email-protection"data-cfemail="6b8fc8c

2、25259585b5d5b5c59522b1a1a45080406">[email protected]；通讯，王欢（1977-），女，辽宁沈阳人，主要从事生物技术研究，（）13654011667（电子信箱）ｚａｎｈｕａｎ＠１６３．ｃｏｍ。农业是其他生产的基础，关系到人类的生存问题，而农业中的关键问题之一就是病虫害的防治。随着可持续发展思想的出台，生物防治成为各国研究的重点。昆虫病原线虫共生菌以其杀虫迅速、对人畜安全、寄主范围广、抗逆性强等优点，引起国际高度重视。随着对昆虫病原线虫共生菌研究的不断深入，共生细菌的多种生物学功能陆续被发现，

3、其次生代谢产物具有杀虫、抑菌、抗肿瘤和杀线虫等多种生物活性，是一类新型的具有开发潜力和应用前景的生物资源［１－５］。本研究初步分离了共生菌的代谢产物，通过生物测定对不同品系昆虫病原线虫共生菌毒素的抑菌活性进行评价，为共生菌的开发利用提供基础数据和试验方法，为进一步深入研究共生菌抑菌活性提供物质基础，为开发新的生物杀菌剂提供新材料。１材料与方法１．１材料供试真菌：水稻恶苗病菌。供试昆虫：大蜡螟幼虫（Ｇａｌｌｅｒｉａｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）。供试试剂：碱性ＥＤＴＡ溶液（NaHCO3１０ｇ／Ｌ；ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ８．０）；透析袋（国产２７．７ｍｍ

4、，透析相对分子质量１２０００～１４０００Ｄ）。供试培养基：牛肉汤培养基；NA培养基；ＰＤＡ培养基；鉴别培养基。供试线虫品系：Ａ２４，ＨＺ，ＮＣ３４，Ｏｔｉｏ，１５－２，Ｈｔ１，１，２，ＳＹ５，８，０３１００Ｃ，０３１０１Ｙ，０３１２１Ｈ，０３１２－４，０３２１－２，０３５５ＢＣ，０３５５ＤＪ，０３５６Ｈ，０３６１Ｄ，０３６２Ｗ，０３８４Ｑ，０３８５Ｄ，０３８６Ｌ，０３８９，０３９６Ｙ，０３９７Ｃ２，０３９８Ｂ，０３９９Ｈ。１．２方法１．２．１共生菌的分离用昆虫病原线虫感染健康的大蜡螟５龄幼虫，虫体死亡后对其表面消毒，将其体液接种于鉴别培养基（ＮＢＴ

5、Ａ）２８℃恒温箱中培养［６］，待平板上出现单菌落时，观察菌落颜色，蓝色为Ｉ型菌，红色为ＩＩ型菌［７］，挑取单菌落于ＮＢＴＡ平板上划线纯化一次，再挑取单菌落转接于ＮＡ斜面培养基，放于２８℃恒温箱中培养后，放到冰箱中４℃保存［８］。１．２．２透析袋的处理在碱性ＥＤＴＡ溶液中将透析袋煮沸１５ｍｉｎ，用去离子水彻底清洗；然后放在１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中再煮沸１５ｍｉｎ，冷却后，存放于４℃备用。１．２．３共生菌毒素的初步提取将菌株分别接入牛肉汤培养基中，１６０ｒ／ｍｉｎ、２８℃振荡培养４８ｈ，制成发酵液后，在冷冻离心机中（４℃，１００００ｒ／ｍ

6、ｉｎ）离心１５ｍｉｎ，取其上清液，加入饱和硫酸铵至８５％，４℃静置过夜，再于冷冻离心机中离心１０ｍｉｎ，取其沉淀用少量去离子水溶解，在去离子水中透析４８ｈ，期间多次更换去离子水，彻底去除溶液中的硫酸铵，再将菌液放入冷冻干燥机中冷冻干燥４８ｈ，所得干粉即毒素的粗提物，于－２０℃保存，备用。生物测定时将毒素溶于去离子水中配成５ｍｇ／ｍＬ即为供试样品。１．２．４共生菌毒素对水稻恶苗病菌的抑菌试验将灭菌后的直径为６ｍｍ的小圆滤纸片在供试样中浸润５ｍｉｎ后，放入ＰＤＡ培养基平板中心，将水稻小斑菌分４块放在滤纸片的四周，距培养皿边沿２ｃｍ处。每平板为１个重复，

7、每处理设３个重复，设置去离子水为对照，放置于２７℃恒温培养箱中培养，５ｄ后测量抑菌圈大小，对各数据用ＳＰＳＳ１７版统计分析软件进行单因素方差分析。２结果与分析由表１可知，２８个品系共生菌菌株的毒素对水稻恶苗病菌均有抑菌活性。经ＳＰＳＳ分析，共生菌ＮＣ３４-3B毒素的抑菌活性最高，对水稻恶苗的抑菌圈半径为１７．５０ｍｍ，而抑菌圈半径与ＮＣ３４－３Ｂ无显著差异的菌株为Ａ２４-6R、１５－２－１Ｒ、Ｈｔ１－１Ｒ、１－１Ｒ、２－２Ｒ、ＳＹ５－５Ｂ、０３２１－２－１Ｂ、０３５５ＢＣ－１Ｂ、０３５５ＤＪ－３Ｒ、０３６２Ｗ－１Ｂ、０３８９－２Ｒ、０３９７Ｃ２－１

8、Ｂ、０３９８Ｂ－２Ｒ，抑菌圈半径分别为１５．１７、１５．００、１５．７０、１５．８３、１６．５０、１５．６７、１６．３３、