清脉饮含药血清对体外tnf

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1、清脉饮含药血清对体外TNF康浩浩1魏齐1魏彦宁1张伟芳2赵凯3*1.宁夏医科大学，宁夏银川750004；2.宁夏医科大学附属回医医院，宁夏吴忠751100；3.宁夏医科大学总医院中医科，宁夏银川750004【摘要】目的：研究清脉饮含药血清对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞（Ehay926）的影响。方法：制备含药血清；将体外培养的EAhy-926细胞，随机分为正常对照组、清法组、活血组、全方组、软坚组、西药组、TNF-α损伤组等；清脉饮含药血清与TNF-α共同处理血管内皮细胞24h后，光学显微镜（下称光镜）下观察细胞的形态变化，电子显微镜

2、（下称电镜）下观察细胞的细胞器改变。结果：①光镜下细胞大体形态变化：清脉饮含药血清与TNF-α共同处理的细胞，各组损伤均较少，细胞数量多，活血组细胞数量相对较少；②电镜下细胞结构的改变：清脉饮含药血清与TNF-α共同处理的细胞器损害较单纯TNF-α损伤组的细胞小，其中以中剂清法组、软坚组、西药组对细胞器的损伤最少，细胞的超微结构与正常对照组比较没有明显差异。结论：清脉饮含药血清可一定程度上对TNF-α损伤的血管内皮细胞保护作用，减少其对细胞器的损害，且含药血清对细胞的保护作用存在血清浓度差异，其机制可能与抑制TNF-α的促炎作用以减少其对细胞器的损害有关

3、。.jyqka批号：BCBH2085V，美国Sigma公司）。SD雄性大鼠60只，体重(250±50)g，普通级，由宁夏医科大学动物中心提供［scxk(宁)2013-0035］。1.2药物全方（清脉饮）：垂盆草、大黄、昆布、煅牡蛎、丹参、蒲黄、姜黄、夏枯草、茵陈、泽泻、海藻等；清法组：大黄、垂盆草、夏枯草、昆布等；软坚组：昆布、煅牡蛎、海藻、夏枯草等；活血组：丹参、蒲黄、姜黄、大黄等；以上中药均由宁夏古方大药房提供，各组方药分别按照传统中药煎煮方法，煎煮、滤液，根据大鼠的体重计算用药量后，浓缩至需要浓度［5］，用蒸馏水配制。西药组：辛伐他汀片（批号：11

4、0622，山东罗欣药业股份有限公司）10mg/片。2实验方法2.1含药血清的制备2.1.1分组及给药方法将56只雄性SD大鼠随机分为八组（即正常对照组、低剂量清法方组、中剂量清法方组、高剂量清法方组、全方组、软坚方组、活血组、辛伐他汀组），每组7只。按体型系数换算法［6］中人鼠等效药量换算方法计算给药剂量，全方组16.9g/（kg·d），低剂清法方组2.9g/（kg·d），中剂清法方组5.99g/（kg·d），高剂清法方组12.21g/（kg·d），软坚方组2.61g/（kg·d），活血方组1.7g/（kg·d）（均为生药量），辛伐他汀组0.67mg，给

5、大鼠灌胃，同时以等量生理盐水灌饲正常对照组，每日一次。2.1.2动物采血及分离血清每天灌胃2次，连续3d后，当夜禁食不禁水，第4d再给药一次，中药组在末次给药后1.5~2h，西药组在给药后1h心脏采血；加盖静置2h后，待血液固缩，无菌条件下分离血清，离心（3000r/min，15min）；同组混合用0.22μm的滤器过滤以消除个体差异，再水浴锅灭活（56℃，30min），分装1mlEP管中，-20℃保存备用。2.2TNF-α的溶解及配制①试剂开盖前，将TNF-α冻干粉离心5min，3000~3500r/min；②用无菌水重悬至0.1~1.0mg/ml，用

6、移液枪的枪头轻吹几下，即可使细胞因子完全溶解，不可振荡，将重悬液静置于室温下2h以上；③用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成20ng/ml，分装，-20℃保存备用。2.3人脐静脉内皮细胞（EAhy-926）培养细胞由上海市中国科学院细胞库提供，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，同时加入100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素，在37℃，体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养细胞；待细胞生长至近汇合状态、铺满瓶壁80%以上时，进行传代；将生长良好的人EAhy-926用0.25%的胰蛋白酶1ml消化1~3min后，轻轻吹打制成细胞悬液，每周传代2~

7、3次；取对数生长期的细胞消化后以1×105/ml，接种于96孔板中培养，待细胞处于增殖期后分组实验。2.4细胞的分组及给药方法取对数生长期的细胞，将其消化，以含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液以1×105/ml，200μl/孔接种于96孔板或4×105/ml接种于25cm培养瓶中，37℃，5%CO2培养24h，细胞贴壁，近乎融合，吸弃培养液，用含0.2%胎牛血清的DMEM培养液静止24h，使细胞同步化至G1期，然后随机分为9组：正常对照组；TNF-α组；低剂清法组；中剂清法组；高剂清法组；全方组；软坚组；活血组；西药组。加入TNF-α及各浓度含

8、药血清，37℃，5％CO2，培养育24h，待测。2.5实验方法2.5.1光镜观察