水产品中6种氟喹诺酮类药物

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1、水产品中6种氟喹诺酮类药物1材料与方法1.1材料与仪器环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、双氟沙星、氧氟沙星、孔雀石绿标准品(纯度≥98.0%)和辣根过氧化物酶(HRP)美国Sigma公司;培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹和氯霉素标准品(纯度≥95.5%)德国Dr.Ehrenstorfer公司;抗环丙沙星单克隆抗体MAb-CIP和包被原CIP-OVA(本实验室制备);包被液、PBS缓冲液、封闭液、TMB底物液和底物缓冲液等ELISA所需试剂均按文献[13]方法配制;辛酸、硫酸铵和过碘酸钠(分析纯)广州化学试剂厂;鱼虾类样品购于广州市内农贸市场;实验用水18.2m

2、Ω.cm超纯水，其它试剂均为分析纯。VersaMax酶标仪和MultiolecularDevices公司;API3000三重四级杆液质联用仪美国应用生物系统公司;R210型旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司;BiofugeStratos台式高速冷冻离心机美国Thermo公司。1.2实验方法1.2.1酶标抗体的制备采用过碘酸钠法[14]，将辣根过氧化物酶(HRP)与经过辛酸硫酸铵法纯化的抗环丙沙星单克隆抗体(MAb-CIP)偶联，制备酶标抗体MAb-CIP-HRP。1.2.2dcELISA检测步骤1.2.2.1包被用包被液将包被原CIP-OVA(稀释至合适浓

3、度，每孔100μL添加到酶标板孔中，4℃放置过夜。1.2.2.2封闭用洗涤液洗涤2次，甩干后每孔加入封闭液120μL，37℃温箱中封闭3h，甩干孔中液体后置于37℃烘箱中烘干备用。1.2.2.3加样用PBS缓冲液将药物标准品稀释成系列浓度，将酶标抗体MAb-CIP-HRP稀释3000倍，每孔加入药物标准液(或待测样品)和酶标抗体各50μL，轻摇混合，37℃温箱中孵育反应40min后洗涤液洗涤5次，甩干。1.2.2.4显色与测定将TMB底物液与底物缓冲液体积比1﹕1混合后，每孔100μL添加到板孔中，37℃温箱中显色10min后每孔加入50

4、μL终止液终止显色反应，酶标仪测定其在450nm处的吸光度(A450nm)。1.2.2.5数据分析以药物标准液浓度的对数值为横坐标，以B/B0(B为添加药物时的吸光值，B0为不添加药物时的吸光值)为纵坐标，使用OriginPro7.5软件四参数对数函数进行曲线拟合，绘制对应的竞争标准曲线，计算获得dcELISA的最低检测限(LOD，IC10)，半抑制浓度(IC50)、线性检测范围(IC20～IC80)等参数[13]。1.2.3样品提取与净化鱼类样品去鳞、去皮，沿背脊取肌肉;虾去头、去壳，取肌肉部分。样品均质处理成肉糜状的待测试样。准确称取试样5.0g，置于

5、50mL聚苯乙烯离心管中，加入20mL酸化乙腈(含1%的乙酸)，均质处理1min，漩涡混合2min，超声波提取5min，以4000r/min离心5min，上清液转移至蒸发瓶中。残渣中加入15mL酸化乙腈，重复提取一次后合并两次提取液，于45℃下减压蒸干溶剂。用2mLPBS缓冲液和5mL正己烷充分复溶，漩涡混合2min后，弃去上层正己烷，用5mL正己烷重复上述操作一次。移取下层液体并用PBS缓冲液定容至10mL比色管中，取50μL直接用于dcELISA检测。2结果与分析水产养殖业的效益释解：１指标设计与数据1.1指标设计当前学者利用DEA方法研究农业全要素生

6、产效率时，产出指标经常使用农林牧渔总产值和农民人均农业经营纯收入，投入指标以农业从业人员、农作物总播种面积、农业机械总动力和化肥施用量等指标为主。本文借鉴前人的研究成果，使用的农业投入指标和产出指标及其定义如下。水产养殖业产出以1990年价格的水产养殖业总产值进行计算，其中包括以1990年价格计算的海水养殖产品总产值和淡水养殖产品总产值，采用水产品价格指数进行折算。水产养殖业投入主要包括养殖专业劳动力、养殖面积、养殖固定资产投入与养殖中间消耗等4个方面。①渔业劳动力包括捕捞专业劳动力、养殖专业劳动力、兼业劳动力和后勤服务人员，后两个指标为概括性指标。为了统一口径

7、，本研究选用养殖专业劳动力作为养殖劳动力指标。②水产养殖面积为每年的海水养殖面积和淡水养殖面积之和。③水产养殖固定资产投资为每年的海水养殖固定资产投资和淡水养殖固定资产投资之和。1.2数据在确定水产养殖业的投入与产出指标之后，着手进行数据的收集与整理。本研究设计指标数据中，海水养殖产品总产值、淡水养殖产品总产值、养殖专业劳动力、养殖面积、海水养殖固定资产投资与淡水养殖固定资产投资等6个指标的数据主要来自《中国渔业统计年鉴(1990-2010)》，其中养殖固定资产投资指标的2008年和2009年数据为预测值;渔业中间消耗指标的数据来自《中国农村统计年鉴(1991-

8、2010)》。水产品价格