评价布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保护效果

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1、评价布氏菌活疫苗的免疫原性和免疫保护效果　　布氏菌病（Brucellosis，简称布病）是布氏菌引起的能够在人和动物中传播的一类人兽共患病。布氏菌具有侵袭力强、传染途径多、引起多器官损伤的特点。家畜感染后如果得不到良好的治疗可引发母畜流产和不育，人感染则主要引起波浪热和转化为慢性感染。据调查，全球已有170多个国家和地区有布病发生和流行。而我国28个省市区的人、畜有布病存在和流行，每年造成近千万元损失。　　疫苗接种是防治布病最有效、最经济的手段。　　布氏疫苗主要包括灭活苗、减毒活疫苗、菌体组分疫苗以及现在热门研究的基因疫苗和重组蛋白疫苗

2、等。目前，我国采用的人用布氏菌活疫苗为牛种弱毒株104M菌株，接种方式为皮上划痕。该方法操作复杂、不能定量接种，人群接种阳转率低，保护效果有限，被接种者因划痕产生疼痛而不易被接受，从而影响疫苗的广泛使用。鉴于布病疫情控制的需要，我们采用具有经济性好和安全性高的皮内注射接种方式替代传统的皮上划痕。本次研究以小鼠为动物模型，采用皮内注射方式免疫，从体液免疫、细胞免疫和保护力试验三个方面的结果全面评价疫苗的免疫原性和免疫保护效果。　　1、材料与方法　　1.1主要材料　　1.1.1动物SPF级BALB/c小鼠，6~8周，白色雌性，共30只，由中

3、国食品药品检定研究院（简称中检院）实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2009-0017，饲养于中检院清洁级动物室。　　1.1.2菌种皮下注射用布氏菌活疫苗及羊布氏菌M5弱毒株均由中检院结核病疫苗室提供。　　1.1.3实验仪器Bio-II-A生物安全柜购自西班牙Telstar公司；Dragon-MK3酶标仪购自芬兰Labsystems公司；DH6000AB型恒温培养箱购自天津市泰斯特仪器公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司；酶联斑点分析仪购于美国CTL公司；CO2培养箱购于美国Napco公司；加样枪购于Gil

4、son公司。　　1.1.4试剂耗材牛血清白蛋白和ConA购自美国Sigma公司；小鼠IFN-γ酶联免疫试剂盒购自美国BD公司；达优-淋巴细胞分离液、无血清培养基、IFN-γ及IL-4ELISA预包被试剂盒均购自达科为生物技术公司；碱性磷酸酶标记羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a购自美国Bethyl公司；pNPP底物显色液购自美国SurModics公司。　　1.2方法　　1.2.1动物分组及免疫将30只BALB/c小鼠随机分成3组，每组10只，分别为低剂量组（5107/只），高剂量组（2108/只），生理盐水对照

5、组，3组均为后肢皮下注射，剂量为0.2ml/只。　　1.2.2动物血清和脾脏淋巴细胞的制备免疫4周后，对每只小鼠进行摘眼球取血，分离血清，–20℃保存，用于ELISA体液免疫检测。将每只动物无菌取出的脾脏放在筛X上，滴加淋巴细胞分离液研磨，研磨液用巴氏管吸入到15ml离心管中，滴加200~500μl达优无血清培养基进行低速梯度离心，在25℃条件下，800g离心30min，吸出淋巴细胞层，加入10ml无血清培养基，颠倒洗涤，室温、250g离心收集细胞，用于ELISPOT细胞免疫的检测。　　1.2.3体液免疫检测　　1.2

6、.3.1抗菌体抗原总IgG抗体水平检测用间接ELISA法检测小鼠血清IgG的效价。以灭活布氏菌体5108/ml的浓度包被96孔酶标板，4℃过夜；以TBS-T300μl洗板5次，用1%的BSA封闭（200μl/孔），37℃静置1h；每孔加入100μl的50开始倍比稀释的待检血清，37℃静置1h；按1:1000倍稀释碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG，洗板后100μl/孔加入，37℃静置1h；洗板，加入100μl/孔的pNPP底物显色液，室温避光30min后加入100μl/孔终止液（3mol/LNaOH）终止

7、反应；在波长为405nm处检测吸光值A405。　　1.2.3.2抗菌体抗原IgG抗体亚类检测以灭活布氏菌体5108/ml的浓度包被96孔酶标板，小鼠免疫4周后血清为一抗，碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG1、IgG2a为二抗，其余操作步骤同1.2.3.1。　　1.2.4细胞免疫检测　　1.2.4.1分泌IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞的数目检测小鼠免疫4周后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，取96孔细胞培养板，每孔中加混有2.0106个/ml浓度细胞100μl，每孔分别加入100μl布氏PPD抗原（终浓度为5μg/ml

8、和10μg/ml）和灭活菌体抗原（终浓度为1108/ml和1107/ml）。每种抗原刺激物做复孔，另用细胞培养液作阴性对照，一孔加ConA作阳性对照（终浓度为5μg/ml）。共同孵育16h后，按