荧光偏振常用荧光标记物

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1、目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种。异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。480/535：5-氨基荧光素AF，EDF和HDF四乙基罗丹明(rhodamine,RB20

2、0)RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如，4-甲基伞酮

3、-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。5．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)等的螯合物可发射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间分辨荧光免疫测定。镧系镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长

4、，最适合用于分辨荧光免疫测定。藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。多甲藻叶绿素蛋白（PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值

5、约为677nm。FL3探测器检测PerCP。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。FL2探测器检测PI。中间体异硫氰酸荧光素乙二胺（fluoresceinthiocarbamylethylenediamine，EDF）和异硫氰酸荧光素己二胺（fluoresceinthiocarbamylhexylenediamine，HDF）合成：用甲醇配制1%的三乙胺溶液，分别将20

6、mg（0.3mmol）乙二胺和34.8mg（0.3mmol）己二胺溶于5ml甲醇三乙胺溶液中；再将11.7mg（0.03mmol）FITC溶于1ml甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺和己二胺溶液中，室温避光搅拌反应1h，浓缩，硅胶柱层析（乙酸乙酯﹕甲醇＝3﹕1，v﹕v），得到粉末状的EDF和HDF，电喷雾离子化质谱（ESI-MS）鉴定后，备用。名称吸收波长发射波长标记何基团FITC490～495nm520～530nm－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ羟基荧光素（ＦＡＭ）492518－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ四氯荧光素（ＴＥＴ）521538－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ六氯荧光素，Hexachlor

7、ofluorescein535556－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ四乙基罗丹明（ＲＢ２００）570nm595～600nm－ＮＨ2四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm－ＮＨ2羧基四甲基罗丹明（ＴＡＭＲＡ）560582－ＮＨ25-氨基荧光素（AF）二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等都可用于蛋白质标记。近年来，菁染料逐渐受到人们的关注。目前研究比较活跃的标记菁染料主要有两大类，一类是噻唑橙（ｔｈｉａｚｏｌｅｏｒａｎｇｅ，ＴＯ）、唑橙（ｏｘａｚｏｌｅｏｒａｎｇｅ，ＹＯ）系列及