芽孢杆菌胞外碱性蛋白酶优化生产

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1、芽孢杆菌胞外碱性蛋白酶的优化生产楚卫华摘要从牛奶加工厂、屠宰场附的水体和土壤中采集菌样，并分离出35株能够分泌碱性蛋白酶的菌株。枯草芽孢杆菌APP1菌株是碱性蛋白酶的高产菌株。将培养条件进行优化即可获得最高产量的蛋白酶。在50℃、pH9.0的条件下培养48小时，即可使培养物保持2,560U/ml的最高产酶活力。优化条件如下（/g）：豆粕15；小麦粉3；K2HPO44；Na2HPO41；MgSO4·7H2O0.1；Na2CO36。在SDS和氧化剂存在时碱性蛋白酶能够显示出极强的稳定性。将APP1菌株产生的碱性

2、蛋白酶分别用5%的SDS和5%的H2O2处理72h，仍能保持73%以上的活力。关键词：芽孢杆菌产酶条件胞外碱性蛋白酶综述蛋白酶是最重要的工业用酶之一，约占世界上酶生产总量的60%。在各种蛋白酶中，微生物蛋白酶在生物技术的加工过程中具有重要作用。其中，碱性蛋白酶是一种重要的工业用酶，它们被广泛应用于洗涤剂、食品、药品以及皮革的生产制造，蛋白质的水解、电影工业以及工业废水的处理等领域。近年来，大量研究显示，从不同生物体如细菌、霉菌、酵母菌以及哺乳动物组织中获得的碱性蛋白酶具有不用的特性。虽然蛋白酶在自然界中的分

3、布广泛，但微生物却是获得蛋白酶的首选。因为微生物的繁殖速度极快，占用的培养空间小，并且微生物为满足自身需要，在培养条件改变时易于获得转基因的新品种。在近期的研究中，我们报告的分离到的这个菌种（APP1），是一个生产胞外碱性蛋白酶的潜力菌株。材料和方法样本采集、分离和筛选从牛奶加工厂、屠宰场的排水沟中采集土样。用生理盐水稀释后，将1g土样置于蒸馏水的强力涡流中，静置后取0.1mL稀释液直接浇注到镀有酪蛋白的碱性固体琼脂培养基上。37℃条件下培养48h后，挑取单个菌落在碱性酪蛋白琼脂平板上划线分离，重复两次。挑

4、取单菌落在脱脂牛奶的琼脂平板上划线培养。脱脂牛奶平板成分：蛋白胨(0.1%，w/v）,NaCl(0.5%，w/v),琼脂（2.0%，w/v），脱脂牛奶（10%，v/v）。根据培养后单菌落周围透明圈的大小，确定其产碱性蛋白酶能力的强弱，筛选出蛋白酶的高产菌株，进一步研究。菌种鉴定菌种鉴定是基于微生物的形态学特征以及生理生化特征，然后将测得的一系列数据与《伯杰氏系统细菌学手册》中记录的模式种对比，从而鉴定出菌种类别的方法[2]。蛋白酶的测定在0.1mol/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲液（pH11.0）中加入0.5％酪

5、蛋白，进行碱性蛋白酶活性的测定[14]。一个酶活力单位是指在标准条件60℃下，每分钟催化1.0μmol底物转化为产物的酶量作为一个酶活力单位。酶的生产及优化从平板上选取透明圈大小合适的芽孢杆菌单菌落来研究蛋白酶活力。将菌落接种到TSB培养基平板上，置于4℃条件下培养。基本培养基配方（/g）：K2HPO44；Na2HPO41；MgSO4·7H2O0.1；Na2CO36；PH7.5。将碳酸钠溶液分别灭菌，然后添加到培养基中，取500ml烧瓶中培养24h的培养物1mL接种到培养基上（100ml）。在37℃下以25

6、0转/分的速度摇瓶培养48h。通过离心分离（8000g，4℃，20min）收集上清液，为酶活力的测定做准备。为了研究微生物的生长动力变化，吸取10%的菌悬液接种到100ml的灭菌培养基上，并于37℃下摇瓶培养24h（100rpm）。在600nm处对微生物的生长进行检测，然后收集样品并离心分离（6000rp，15min），收集上清液用于酶的测定。通过改变和控制培养基的条件，对烈性菌株进行详细的研究。优化培养条件，可以使蛋白酶的产量达到最高值。例如控制培养时间（12h，24h，48h，72h），培养基的pH（5

7、.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0），培养温度（37℃，50℃，65℃，70℃），碳源（小麦粉，葡萄糖，乳糖，麦芽糖），氮源（蛋白胨，豆粕，酪蛋白，硫酸铵）（表一），并添加表面活性剂和氧化剂。记录这些因素对蛋白酶产量的影响。表一不同的碳源氮源对APP1菌株产蛋白酶能力的影响氮源浓度（%）蛋白酶活（U/ml）碳源浓度（%）蛋白酶活（U/ml）豆粕0.51,023小麦粉2.0678.41.52,5603.01,110.52.01,3644.0829.0蛋白胨1.0836.3麦芽糖

8、0.51,025酪蛋白1.0650葡萄糖0.5850硫酸铵1.0160乳糖0.5510在基本培养基中分别添加各种氮源和碳源于37℃下培养48小时。结果鉴定菌种从牛奶加工厂和屠宰场的排水沟附近的土壤中采集五份样品，分离出35份能够产生碱性蛋白酶的微生物菌株。然后将菌株纯化，保藏菌种并测定其生产性能。在初步筛选中，APP1菌株显示出了更强的水解脱脂牛乳中酪蛋白的能力（图一），最后对该菌株生产胞外碱性蛋白酶的实验进一步