电镜观察固定方法

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1、电镜观察固定方法固定：1、取材；取新鲜拟南芥组织2-3mm2或花苞，迅速放入约5ml固定液中（2.5%戊二醛），针筒抽气（抽干细胞液泡内空气）至材料沉入固定液（如抽气2小时，材料还没有沉入固定液中，可不用抽了）换液5ml戊二醛，4度冰箱中保存至少7天。若效果不好，可在管口塞团棉花；漂洗：2、吸出固定液及悬浮未沉下的材料，用1ml磷酸缓冲液（4℃保存PH7.2）冲洗，每半小时一次反复3次，将花苞用小镊子分开；固定，染色：3、吸出磷酸缓冲液，加500ul锇酸（有毒，带手套，避光，用锡箔包裹；渗透力很弱，楼下加）过夜染色（打开抽湿机操作）；漂洗，脱水：4、磷酸缓冲液洗

2、去锇酸，开始酒精脱水过程如下：30%10min50%10min70%10min到70%酒精可存放至晴天脱水较好；（注意：以上均为4℃条件即放在冰上进行，以下几步都在室温下进行）80%15min90%15min95%15min100%30min100%30min（晴天秋季为宜）包埋:环氧丙烷20min环氧丙烷20min包埋剂：环氧丙烷1：3过夜，500ul(注意：100%乙醇和环氧丙烷在使用时，要提前用无水硫酸钠或无水硫酸铜过滤，除去里面水分)5、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（体积比1：1），过夜；6、吸出前一天试剂加入：混合好的包埋剂+环氧丙烷（

3、体积比3：1），过夜；（以上包埋放在摇床上，以便均匀渗透）聚合7、在橡胶小板上加入纯包埋剂，用牙签把材料分别移入橡胶小板的空格内摆放整齐，一般放2个花苞，过夜。（注意：多余的包埋剂置于4℃保存，防止凝固）8、直接把橡胶小板置于65℃条件下聚合48h；9、切片（先切厚片看看，以免重复切片，再切薄片）；10、染色：醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，双氧水漂洗1-2秒；（注意：染色期间不要说话，避免CO2造成切片污染）