cdna文库构建

《cdna文库构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、cDNA文库的构建现代生物技术讲座主要内容基因文库的概念及意义cDNA基因文库的类型几种cDNA文库的介绍SMART技术构建全长cDNA文库一、基因文库的概念及意义文库（library）：指一种全体的集合。基因文库（genelibrary）:是某一生物类型全部基因的集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。基因文库与基因库（genebank）区别基因文库与基因克隆基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。构建基因文库的意义☆使生物的遗传

2、信息以稳定的重组体形式贮存起来;☆是一种分离克隆目的基因的主要途径；☆基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。根据基因类型（重组DNA片段的供体）基因组文库和cDNA文库1、基因组文库★基因组文库(genelibrary)：用重组DNA技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库。它包含该生物所有基因。★根据DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和叶绿体基因文库构建流程抽

3、提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）基因文库限制性内切酶……克隆、转化、培养、鉴定基因组DNA基因文库基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况基因组物理图谱的构建基因组序列分析基因在染色体上的定位克隆鉴定基因调控元件基因组中基因的结构和组织形式分析基因组DNA文库应用结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA2、cDNA文库cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的

4、作用下形成的互补DNA(简称cDNA)。cDNA文库(complementaryDNAlibrary)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，

5、并直接用于该目的基因的表达。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。从1976年HOFSTETTER成功的构建了第一个cDNA文库以来，构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期cDNA文库，由于当时技

6、术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而YOUNG和DAVIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来，cDNA文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需要。cDNA文库优点(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5)cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从cDNA文库中筛选到所

7、需目的基因，并用于该目的基因的表达。一个细胞在任何时间可以产生几千种不同的蛋白质，所有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementaryDNA，cDNA）。信息量远小于基因组文库注意(1)细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cD

8、NA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA文库