过氧化氢测定方法

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1、过氧化氢的测定方法三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法[原理]H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。[仪器与用具]紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。[试剂]0.2mol?L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol?L-1H202(用0．1mol?L-1高锰酸钾标定)。[方法]1．酶液提取称取新

2、鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2-3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。2．测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加入试剂。25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，24

3、0nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。3．结果计算以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）=式中Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2-样品管吸光值；Vt--粗酶提取液总体积(ml);V1--测定用粗酶液体积(ml);FW--样品鲜重(g);0．1-A20每下降0．1为1个酶活单位(u);t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

4、【思考题】1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关?参考文献【1】MukherjeeSP,ChoudhuriMA.DeterminationofglycoalteoxidaseactivetyH2O2contentandcatalaseactivity.PhysiolPlant.1983(58):167-170【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系

5、，植物生理学报.1998,14(1):16-22【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982实验材料：小白菜注意事项：1、三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。2、研磨时CaCO3不要加得太多，大半匙即可，且要洒均匀。3、过滤时不必全部过滤完，有20ml滤液即可。4、把握好实验进度，不拖延时间，以免酶液失活。5、滴定时速度不要过快，以免过量（最快不要超过1秒/滴）。最佳终点为最后半滴加入后蓝色消失。6、每次滴定

6、起点一致，都从零开始。7、左手操纵活塞，右手摇三角瓶，溶液要摇成漩涡状。8、为了保证实验的平行性，四个三角瓶里所加的试剂应该来自同组药品，中途不要试剂瓶（使用别组药品）。结果分析：但本实验的不确定因素很多，比如气温高低、样品差异、试剂新旧，因此较难达到老师的水平。结果偏低的主要原因：1、实验时间过长，酶液失活；2、器皿未洗干净，残存酸或碱，酶活性下降；3、样品滴定过量。结果偏高的主要原因：1、空白样滴定过量。小知识：1、加入过氧化氢之前为什么要保温平衡？答：为了使三角瓶中的溶液温度达到过氧化氢酶的最适酶促反应温度。过

7、氧化氢酶的酶促反应最适温度为20－25℃，受实验室条件限制，如果室温在这个范围内则不进行水浴，在空气中保温。2、为什么有个别组在加入KI溶液后有黑色沉淀出现？答：因为KI溶液放置时间过长易被空气中的氧气所氧化，出现单质I2，这样再加上被过氧化氢所氧化而得的I2，就可能在三角瓶中出现单质I2过饱和，从而析出变成沉淀。遇到这种情况应该更换KI溶液重做。3、为什么不能用NaOH代替H2SO4终止酶活性？答：H2SO4除了利用强酸性终止酶活外还参与氧化还原反应，参与KI生成I2的氧化还原反应;NaOH虽然有强碱性可以终止酶活

8、，但不能参这个反应，这样无法测出过氧化氢的量。【转帖】过氧化氢酶活性的测定方法过氧化氢酶--------------------------------------------------------------------------------：pH值范围4-9,而以7.0,37℃最适。冷冻、冻干、阳光、氧气降酶活。用Beers&Sizer