基因工程常见问题梳理

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1、基因工程常见问题梳理1、什么是里眾活性，产生的原因及解决方案？SS活性是指在极端非标准条件不，限制性内切酶能切割与识别序列相似的序列，而造成误切的现象。产生的原因.•1）廿汕浓度过高，人于5%;2）酶过量，＞100U/ul；3）Mg2+被其他的二价金属离子取代；4）pH过高，＞8.0；5）添加了存机溶剂DMSO、乙醇等；6）离了•强度低，＜25mmol/lo2、限制性内切酶的发现、分类和各类的特点：限制性内切酶的发现是20世纪60年代，噬苘体侵染人肠杆菌之后，DNA在感染宿主巾会被降解，从而提出了限制酶切和限制酶的概念。1970年，H.Smith偶然发现了HindHI,祸丌了

2、限制酶的面纱。主要分为三类：1类、UI类：限制作用需要ATPII类：最常使用的一类限制酶，识别序列主耍有4-6个核苷酸，回文结构，与甲基化的反应分丌，限制作用不需要ATP。3、不同条件的两种限制性内切酶，双酶切时应该采取什么措施？1）同步双酶切：配置同时适合这两种限制酶的最佳缓冲体系，同时加入两种酶；2）分步酶切：分开加酶吋遵循先低盐后高盐原则，而且可以在加入第二种酶的时候使第一种酶失活，避免产生星星活性。3）使用配有特殊缓冲液的酶进行酶切:在人多数怡况下采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液屮进行酶切，这保证Y对媛冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由干内切酶在非最佳缓冲液屮进

3、行酶切吋，反应速度会减慢，因此需要增加酶量，延长反应时间。4、差异杂交的基本原理和思路差异杂交要拥冇两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中的H的某因正常表达，在:W—个细胞群体中的目的基因不表达。在这种情况下便nf制备两种不hd的mRNA提取物。其一是含有目的基因的mRNA的总mRNA,另外一种是不含有目的基因mRNA的总mRNA。因此，讨以通过这两种mRNA的cDNA拷贝为探针，对巾表达门的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。思路：将来ft—种细胞的mRNA反转录形成cDNA的第一链，用这种细胞的cDNA与先一种细胞过量表达的mRNA进行杂交。如果在第一种细胞中是特异表

4、达的mRNA,则会产生特异的cDNA链，不会与第二种细胞的mRNA杂交。通过羟基磷灰石柱层析，洗脱未形成杂交体的cDNA，它代表第一种细胞屮特异表达的基因。以该链为探针，第一种细胞的cDNA文库的重复拷W杂交，跟探针能够杂交克隆的足在组织细胞屮特异表达的mRNA。再对这样的克隆进行测序比较，鉴定，就分离得到这种组织特界表达的基因，所有毡含重组体的菌济，阳性反应在X射线上呈现黑色的点。比较这两种底片对照原〒板。便可以挑选所有含奋0的基因的苘落，供进一步研究使川。5、如何检测外源基因1）外源基因导入基因组中的检测：southern杂交、PCR扩增检测、报告基因检测；2）外源基W在

5、基因组中较录检测：northern杂交；3）外源基因在基因组屮翻译检测：western杂交；4）筛选标记难因：如一些抗性难因表达后可在含抗生素的培养雉上存活；5）直接观察蕋因表达的特殊性状来检测目的蕋因是否表达。6、目的基因重组后不表达的原因。1）导入了特异启动子对该基冈的表达无效；2）启动子与目的基因的SL离过长，表达效果降低；3）由于密码子偏爱性，S的基因含有人量寄主细胞的稀有密码子而造成表达景降低4）真核某因在原核衷达系统中的表达方式不一致；5）寄主细胞中内源蛋內造成外源蛋內降解，或因为修饰系统不同而使外源蛋內活性降低或缺失。7、蓝白斑筛选的原理：某些质粒带有大肠杆菌l

6、acZ突变体lacZ’ffi因，当其与另一个lacZ突变体lacZAM连接时可实现a-互补，编码3-半乳糖苷酶。如果在lacZ’基因的上游插入一段小的DNA片段（如51bp的多克隆位点）则不影响其功能互补。似是再在该DNA片段上插入一段DNA片段,将使得K失去功能互补的特性，无法编码｛3-半乳糖苷酶。非重组体可以在IPTG的诱导下生成P-半乳糖苷酶，作用于X-gal,生成蓝色的歯斑。重组体则不能产生P-半乳糖苷酶，生成A色的菌斑。因此可以通过观察菌斑的颜色来快速鉴别重组体与非重组体。相应的受体菌有JM系列、TGI、XLl-Blue；pUC系列的载体与外源基因的形成的重组体nJ

7、•以进蓝白斑筛选。8、IPTG诱导的原理：1PTG足一种乳糖衍生物，在体外进行乳糖操纵子的研究吋，并不直接使川乳糖作为诱导物，而是使用其衍生物IPTG作为诱导物。IPTG可以与阻遇蛋白结合，使得其不能与lac操纵子结合，使得RNA聚合酶可以与操纵子结合，调控结构基因的表达，产生P-半乳糖苷酶。当无诱导物的吋候，则阻遏饭白与操纵子结合，抑制RNA聚合酶与lac操纵了结合，则结构基因不表达。9、蓝白斑筛选假阳性形成的原因1）插入的小片段不是目的片段；2）携带lacZAM的质粒插入到丫lacZ’®因的内部不形