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1、青霉素酶产生菌蜡样芽孢杆菌的筛选、纯化和诱导徐冰（天津农学院农学系）1前言β-内酰胺酶（青霉素酶）在自然界的各种细菌中广为存在,能够水解各种β-内酰胺类抗生素,是临床致病菌最重要的耐药机制之一。但同时我们可以利用许多非致病菌产生的β-内酰胺酶能够水解β-内酰胺类抗生素的特点,开发其在抗生素药品质量检验、新抗菌药物筛选等方面的应用。一些抗菌药物如青霉素、磺胺类药物、四环素及某些氨基糖甙类抗生素能使部分人群发生过敏反应。过敏反应症状多种多样,轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝织炎等;严重时可出现过
2、敏性休克,甚至危及生命。当这些抗菌药物残留于动物性食品中进入人体后,就使部分敏感人群致敏,产生抗体。当这些被致敏的个体再接触这些抗生素或用这些抗生素治疗时,这些抗生素就会与抗体结合生成抗原抗体复合物,发生过敏反应。英国一对青霉素高度敏感的病人,食用约含10IU/mL青霉素的商品牛奶后,发生了变态反应。在我们平常的生活中由于青霉素的大量使用使环境遭到了破坏，给人类带来了不便。催化水解青霉素β-内酰环产生青霉噻唑酸的一类β-内酰胺酶。国际生物化学联合会（IUB）酶学委员会的酶编号为3.5.2.6。在各
3、种微生物中分布广泛，特别在细菌中更为广泛。由蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus5/B与B.cereus569分别得到分子量为35200与31500的青霉素酶结晶，从巨大芽孢杆菌B.megaterium提取出α，β，γ青霉素酶结晶，随后从不同细菌又分离出多种青霉素酶。青霉素酶对热极不稳定，分解β-内酰胺的速度因青霉素与酶的种类不同而异，但对6-氨基青霉烷酸（6-APA）作用却很微弱。酶反应最适PH值为6.0～6.5.以青霉素G钾盐为底物，Km为4.32×10-3M(5/B酶)；4.89×10-
4、3M(569酶)。细菌产生青霉素酶导致出现耐药性，临床上已分离出多种类型青霉素酶，白色粉末。分子量50000。溶于水。酶溶液易失活，冻干品2～8℃可稳定一周。青霉素酶作用于青霉素的β-内酰胺环，使青霉素转变为无抗菌活性的青霉素酮酸（penicilloicacid）。医疗上用于青霉素过敏症状的治疗。青霉素酶在实验中用于破坏或抑制青霉素活性-12-β-内酰胺酶（β-lactamase），可水解β-内酰胺类抗生素。已发现二百多种β-内酰胺酶。青霉素酶的分类方法主要有两种，分子生物学方法和BUSH法。
5、 分子生物学法将酶分为四类。A类酶包括多种质粒编码的青霉素酶，活性部位为丝氨酸残基，分子量为29kDa。B类酶为金属酶，由染色体或质粒编码，酶活性需锌离子参与，可被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制。C类酶的活性部位为丝氨酸残基，分子量为39kDa，其产生与诱导剂有关。C类酶主要指染色体编码的头孢菌素酶（AmpC酶）。D类酶又称为OXA型（水解苯唑西林）β-内酰胺酶。 另一种分类方法为BUSH分类法，依底物及抑制剂谱不同，也将酶分为4类。第一类为头孢菌素酶（AmpC酶），由染色体介导。第二类为青
6、霉素酶和超广谱酶。第三类为金属酶。第四类为其它不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶。由于青霉素的大量使用和乱用带来的一些危害，我们有必要来生产青霉素酶来分解青霉素，这样可以减少一些青霉素过敏反应带来的危害，也可以减少乱用青霉素带来的环境污染。这使青霉素敏感人群的安全性得到了进一步的提高，使我们的环境更加安全。青霉素G是目前医药工业中的最重要抗生素类产品,具有抗菌活性强,疗效高,毒性低等优点,一直是治疗敏感性细菌感染的首选药物。我国青霉素年生产能力达到12000吨以上,占全球年产量的50%,是世界青霉素
7、生产大国[2]。青霉素G结构中的β-内酰胺环不稳定,在酸、碱、高温、酶等作用下发生降解,生成的物质易与蛋白或多肽结合,生成致敏性高分子杂质,导致过敏反应的发生[3]。青霉素过敏反应表现形式多种多样，以过敏性休克最为严重，常常发病迅速。其临床症状主要表现为呼吸道阻塞症状（呼吸困难、胸闷）;循环衰竭（大汗淋漓、紫绀、脉搏细弱、血压下降）;中枢神经系统紊乱（意识障碍、昏迷、抽搐、大小便失禁等）。目前工业生产中大多采用溶媒萃取法从发酵液中分离青霉素G,pH118～2.5时用乙酸丁酯进行萃取,pH6.8～8
8、.0时用碳酸氢钠进行反萃取,然而收率只有80%～90%,据文献报道[4],其主要原因由青霉素G不稳定降解造成。医学界流行一句话:在美国买枪很容易,但买抗生素却很难,而中国正好相反。目前,中国的门诊感冒患者约有75%应用抗生素,外科手术则高达95%,世界卫生组织调查表示,中国住院患者抗生素药物使用率高达80%,其中使用广谱抗生素和联合使用两种以上抗生素的占58%,远远高于30%的国际水平[5]。专家说凡超时、超量、不对症使用或未严格规范使用抗生素,都属于抗生素滥用[6]。我们常看到这
