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1、ABCC10在浸润性乳腺癌中的表达及耐药研究扬州市第一人民医院江苏扬州225001摘要：目的：检测ABCC10在浸润性乳腺癌组织中的表达，探讨其与组织学类型、分级和TNM分期的关系，检测ABCC10阳性与阴性癌组织对化疗药物的敏感性。方法：采用免疫组化EnVinsion法检测ABCC10在55例浸润性乳腺癌组织中的表达，进行统计学分析。采用MTT法检测相应癌组织对化疗药物的敏感性，分析其与ABCC10表达的相关性。结果:ABCC10主要定位于胞膜上和胞质中。阳性率为67.3%,不同病理分级、TNM分期间ABCC10表
2、达差异均有统计学意义(P=0.002、0.001)。乳腺癌组织的耐药性试验结果与其相应组织中ABCC10的表达做相关性检验，紫衫醇、多丙他赛、表阿霉素(P=0.000),相关系数分別为分別为0.561、0.614、0.512。结论:ABCC10在乳腺癌组织中高表达，表达的高低与组织学分级,TNM分期成正相关，显著影响紫杉醇等化疗药物的耐药产生。关键词：乳腺癌，化疗，耐药【中图分类号】R712.5【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0135-02化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分，但化疗的疗
3、效与肿瘤细胞是否耐药有密切的关系，一旦出现耐药现象，包括原发性和继发性耐药，则会导致化疗疗效差，对于乳腺癌化疗耐药的研究，目前热点在于肿瘤耐药基因及其相关蛋白的研究［1］。研究表明ABC家族膜转运体在耐药中起主要作用［2］,ABC膜转运蛋白家族即ATP结合盘(ATPbindingcassette,ABC)膜转运蛋白家族，其耐药作用是通过膜转运蛋白把细胞癌细胞内的化疗药物泵出细胞外来实现，ABC家族的一个亚家族(C族)也称为MRP(multidrugresistanceprotein,多药耐药相关蛋白)家族，人类ABC
4、C10(MRP7)是MRP家族最新发现的成员［3］。但ABCC10与乳腺癌的关系研究甚少，木文就乳腺癌中ABCC10的表达以及对常见乳癌化疗药物的耐药实验，来对乳腺癌耐药的机制做一个探讨。1材料与方法1.1标本来源收集2014年11月-2015年11月我院乳腺外科浸润性乳腺癌组织手术切除标本及相应正常组织55例。患者平均年龄(56.13&plUsmn;8.70)岁，中位年龄61岁。其中髓样癌3例，粘液癌1例，浸润性导管癌51例,手术前患者均未行化疗或放疗。术后即刻将标本置于预先盛有无菌RPMI1640培养液的无菌管中
5、，部分新鲜癌组织用于化疗药物药敏试验，将相应标本用10%甲醛固定，经脱水、透明，常规石蜡包埋。由病理科经验丰富医师进行癌组织病理分类、分级诊断，术后进行TNM分期。1.2主要试剂ABCC10兔抗人多克隆抗体购自美国SantaCruzTechnology公司，二抗购自美国SantaCruzTechnology公司，免疫组化试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。紫杉醇、多西他赛购自扬子江药业、表阿霉素、环磷酰胺、吉西他滨、长春瑞滨分别购自辉瑞制药有限公司、德国BAXTERONCOLO公司、江苏豪森药业、吉林一心药业公司。RP
6、MI1640、胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶和购自Amroso公司，MTT和DMSO为Sigma公司产品。1.3方法1.3.1癌组织药物敏感实验将新鲜癌组织用含青链霉素的生理盐水反复冲洗，匀浆破碎癌组织，用尼龙膜过滤后，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度到105mL-1,台盼蓝染色计数；将细胞悬液接种于96孔培养板,190μL/孔，设空白组、对照组和实验组(实验组分为高浓度和低浓度组)，每组设4个复孔；在37°C、5%CO2培养箱培养24h,加入上述化疗药10μL,使高浓度组的终浓度为人体
7、血浆浓度。阴性对照孔和空白孔加10μLRPMI1640,培养48h后每孔加入5mg/mL的MTT20μL,继续培养4h。吸去上清后,每孔加入二甲基亚砜150μL,混匀，振荡培养板lOmin,使孔中沉淀完全溶解。酶标仪读取波长570nm处各孔吸光度值。1.3.2ABCC10蛋白检测标本经5Lm连续切片,分别做HE和免疫组化染色。免疫组化染色采用两步法(EnVisionTM),步骤如下：切片脱蜡至水，尿素消化,3%过氧化氢封闭，用柠檬酸缓冲液进行微波修复,冷却，兔血清封闭，加一抗(lB200)4e过夜。
8、从冰箱取出37e复温，用自来水冲洗抗体，加入山羊二抗(EnVision),37e恒温反应(中间各步用PBS洗)，加DAB显色，显微镜观察终止显色。用苏木精轻微复染，脱水透明封片，在光镜下观察。对照组设正常组织和空白(以PBS代替一抗)对照。1.4判定标准1.4.1药物敏感性判定IR<30%为耐药,31%〜50%低度敏感,51%~70%为中
