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1、人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的论文范文，供大家阅读查看。 大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-deriv
2、edmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。 1材料与方法 1.1材料成人腹部大X膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FI
3、TC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司). 1.2方法 1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大X膜脂肪组织约10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。加入完全培
4、养液(含10%胎牛血清、1双抗的低糖DMEM)重悬，以5104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。实验时用第3~9代细胞。 1.2.2细胞免疫表型检测取消化消化贴壁的第3代hADSCs,1000r/min离心5min,用PBS重悬分装于1.5ml的EP管中，每管100μl,细胞密度为105/ml,加入鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA-DR等单克隆抗体及其同型对
5、照。4℃避光孵育30min,PBS洗2次，加PBS300μl重悬后流式细胞仪检测细胞表面抗原。 1.2.3细胞生长曲线和倍增时间取处于对数生长期的第3、6和9代细胞，消化贴壁细胞，将细胞按5103/孔接种于24孔板，分7组，每组3孔，置培养箱培养。每24h用台盼蓝计数一次，每次计3孔，取其平均数;连续计数7d,将所得数据以天数为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。hADSCs细胞倍增时间按Patter-son公式计算[4]. 1.2.4成脂和成骨分化鉴定将80%融合的第3代hADSCs分别改用成脂诱导培养基(含10%胎牛血清、1双抗
6、、0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛的高糖DMEM)和成骨诱导培养基(含10%胎牛血清、1双抗、0.1μM地塞米松、50μM抗坏血酸磷酸盐、10mMβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM),诱导14d后分别油红染色鉴定脂滴和VonKossa染色鉴定钙结节。 1.3统计学分析以SPSS17.0统计软件对实验数据进行方差分析。当P<0.05时为差异有统计学意义。 2结果 2.1hADSCs细胞分离培养接种48h后可见散在贴壁细胞，呈圆形或梭形，换液除去非贴
7、壁细胞;一般培养7~8d达到80%以上融合，细胞形态逐渐均一，排列趋于方向性，呈放射状或河流状;3~9代的细胞形态无明显改变。 2.2细胞免疫表型检测通过流式检测hADSCs多个细胞表面分子标记物，结果显示CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166表达均在95%以上，CD45和HLA-DR表达均在5%以下。 2.3细胞生长曲线和倍增时间生长曲线显示hADSCs接种后前2d处于潜伏期生长较慢，从第3d开始进入对数生长期呈S形，约在接种第6天进入平台期停止增殖，第3代细胞倍增时间为27.4h,不同代数细胞增殖能力无显着差异(各
8、培养天数F值分别为0.14,0.03,0.78,1.14,0.20,0.18,0.18,对应P>0.05).见图2.【1】 2.
