实验四聚合酶链式反应(pcr)扩增dna片段

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1、实验四聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的•了解PCR扩增DNA片段的原理•掌握PCR扩增DNA片段的技术二、实验原理•多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）:是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。1985年KaryMill1is及同事创立。随后借助于热稳定性TaqDNA聚合酶的发现，使PCK向动化成为可能；1987年KaryMullis等完成了向动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。•原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95°C）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单

2、链DNA模板；而后在低温（37〜65°C）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的吊链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72°C）下，以引物3’端为合成的起点，以单核订酸为原料，沿模板以5’一3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成力下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷W数扩增一倍，PCR产物得以的批数形式迅速扩增，经过25〜30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上

3、，实际上一般可达106〜107倍。•PCR的特点及应用：PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应川于许多领域。1.基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等;2.遗恃摘的产前诊断；3.致病病原体的检测；4.癌基因的检测和诊断；5.DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证;1.动、植物检疫；2.在转基因动植物中检杏植入基因的存在•PCR反应系统的组成PCR反应系统的组成主要包括：引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。引物：要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸

4、引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，因此，引物设计也就更为重要。•引物的设计：1.长度一般最低不少于16个核苷酸，最佳长度为20〜24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点等，以完成基因克隆和其它特殊耑要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。2.两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否

5、则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primerdimer)。3.(G+C)%含量引物的组成应均匀，两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。4.引物内部应避免内部形成明品的次级结构，尤其是发夹结构(hairpinstructures)。•引物在PCR反应中的浓度一般在0.1〜1UM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。•引物返火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但

6、过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一•般可根据引物的(G+C)%念量进行推测，一般实验中退火温度Ta(annealingtemperature)比扩增引物的融解温度Tm(meltingtemperature)低5°C,可按公式:进行粗略计算：Ta=Tm5°C=4(G+C)+2(A+T)-5°CM•屮A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如0.2umol/L），退火反应数秒即可完成。引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70〜75°C,在72"C吋酶催化核苻酸的标准速率可达35〜100个核苷酸/秒。每分钟

7、可延伸lkb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所以根据扩增片段度的不同来设计引物延伸的温度。对于lkb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1〜7min。•寡核苷酸（dNTP）在PCR反体系中，dNTP终浓度高于50mM会抑制Aty酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50〜200uM,不能低于10〜15uMo四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺

8、入，降低合成速度，过早终止反应。•TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶最早是从嗜热水生菌屮提纯出来的。PCK反应混合物屮