利用基因工程生产植物次生代谢产物

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1、利用基因工程生产植物次生代谢产物摘要：植物次生代谢产物对于控制和影响植物性状起着十分重要的作用，也为人类提供了所需的药物、染料、香料等众多的化合物。综述了植物众生代谢途径的研究、相关基因的克隆以及次生代谢的基因工程。    绿色植物是将光能转变成化学能的"生物应应器"，是人类赖以生存的最重要的基础。它不仅为人类提供生命所必需的碳水化合物、脂类、蛋白质等初生代谢物，同时也为人类提供许多有益的次生代谢物。植物次生代谢物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。植物次生代谢物种类繁多，现在已知大约有10000种，包括酚类、

2、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等，一般可分为酚性化合物、萜类化合物、含氮有机物3大类。植物次生代谢物是植物在长期进化中对生态环境适应的结果，对植物在生态系统中的生存起作用，如抗虫、抗病、异株相克、吸引昆虫授粉、与共生微生物相互作用等。    人类利用植物次生代谢物的历史十分悠久，各民族传统草药和香料的有效成分大多是该类物质。中国的本草学则是世界上利用植物天然产物的杰出代表、现在仍从植物中提取的重要药物有50多种。直到今天，这些天然产物仍在人类生活中扮演着重要角色，尤其为医药、轻工、化工、食品及农药等工业的发展所必不可少。随着"回归自然"的呼声日益

3、高涨，人们已认识到现在是从高等植物的次生代谢产物中寻找新药的时代。然而，长期缺少有计划的采集致使生态环境受到破坏，许多野生植物濒危，一些特殊生境下的植物人工引种尤为困难。能够引种栽培的植物也要占用大量农田，加之受环境的制约，使次生物的含量和质量不稳定。此外，在通常情况下，天然植株中目的次生产物含量过低（如紫杉醇）；采用化学合成的方法，又会遇到工艺流程复杂、成本高、产生同分导村体及环境污染等许多问题。近年来，随着对植物代谢生理、生化及生态适应方面认识的深入，以及分子生物学的渗透，植物次生代谢分子生物学研究发展迅速，利用基因工程大规模生产次生代谢产物具有诱人的前景。    1植物基因工程的

4、目标    将外源新基因转入植物的技术现在已很普遍，基因枪和根瘤农杆菌介导是最常用的方法。利用基因工程改良植物性状的可能性多种多样：使内源性抗性化合物（如植物抗毒素）在高水平上表达，表现出更高的抗虫及抗病能力，提高产量和质量；在花卉栽培中培育出特定的花色、花香；改善水果的口味；降低食品和饲料中有毒成分的含量（如饲料中的双吡咯烷类生物碱或芥子油苷，咖啡豆中的咖啡因）；提高有益成分的含量（如番茄中的黄酮，水稻中的维生素A）。    但是次生代谢物或新的化合物在植物中的高水平表达可能导致潜在的毒性，因此对转基因食品（饲料）进行风险评估是必要的，也是必需的。    2次生代谢途径    为了实

5、现上述目标，必须清楚植物的次生代谢途径。现在了解得比较清楚的是黄酮类和萜类的生物合成途径，常用的方法是把用放射性标记的中间体结合在终产物中，作为经由前体代谢的证据。这种方法最主要的问题是中间体的合成十分困难，另外中间体衰变后放射性标记可能通过另外的途径代谢。因此必须挑选稳定的同位素，例如常用的13C在产物中的结合位点可以通过13CNMR来确定。    当酶的活力低下甚至无法从植物中提取到有活性的酶时，需要对多种不同的植物作平行研究。VanTegelen从欧茜草和长春花中提取异长春胺合成酶，花了2年时间都没有从欧茜草中得到所需量的酶，而仅仅用了几个星期就从长春花中获得了足量的纯蛋白用于氨

6、基酸测序。Yamamoto从日本山茶中成功地分离出次番木鳖苷合酶，而从长春花中却没得到。    蛋白质组学为鉴别次生代谢酶提供了新途径，利用二维凝胶电泳进行原位肽的消化，遇过质谱检测可以获得内源氨基酸的顺序。首先，寻找关键酶需要植物体、植物组织或值物细胞在一定条件下生成所需的产物，由这些产物经过凝胶电泳得到蛋白图谱，这时与产物相联的蛋白质就能被鉴别出来。再经过质谱测定的氨基酸序列用于基因克隆研究。最后是证明该基因在代谢途径中的功能，这一步绝非易事。生物信息学可以确定哪种酶是关键酶，但最有力的证据必须是在合适的系统中进行基因表达和合成有功能的蛋白。把植物细胞转入根瘤农杆菌共培养也可能是一

7、种合适的方法，尤其适用于依靠翻译后修饰的酶、共生因子、酶作用底物或者出现其他的酶。一旦没有中间体，就无法测定蛋白质功能。用反义基因推测基因功能和分析次生代谢图谱是用来测定基因表达产物（如蛋白功能）的新方法。    代谢途径中的某一步化学反应可能是没有酶参与的自发反应，例如在吗啡的生物合成过程中异喹啉生物碱转变为可持因酮的反应。另外，一种酶也可以催化两种反应，如莨菪素由6-羟基莨菪碱变为东莨菪碱的反应中起催化作用的6-莨菪碱羟化酶。    在罂粟