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1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定林芸1蔡鹏威2陈为民1孟春3（1福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州350001）（2福建省立医院检验科福建福州350001）（3福州大学生物工程学院福建福州350001）【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁
2、，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞幵始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的牛.长速度变快,逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%,并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可讼满瓶底的80%。传至10代仍異有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45,但表达CD29、CD44,纯度分别为73.8%、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯
3、度增加，且该方法简单、实用。【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能［1］，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫
4、调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景［2］,但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3],因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。1材料和方法1.1材料1.1.1实验动物雄性，C57BL/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g,购于吴氏动物实验中心。1.1.2实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（Sigma公司），青霉素钠（Sigma公司），链霉素（Sigma公司）,5%C02培
5、养箱（曰本三洋公司），流式细胞仪（BDFACSCalibur）,倒置显微镜（OLYMPUS）,大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。1.2方法1.2.1小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%洒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有PBS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌闪组织，移入装冇预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素O.lg八的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两
6、端，用lm丨注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至火菌的10ml离心管中，4°C3000rpm离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4°C3000rpm离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4°C3000rpm离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25
7、cm2培养瓶中，置于5%C02,37°C,饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。1.2.2小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%吋，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37°C条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4°C3000rpm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例
8、接种到新的培养瓶，置于5%C02,37°C,饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%吋，重复以上操作，再次传代。1.2.3小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4°Cl000rpm离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入CD29和CD44
