hbv全基因组克隆转染细胞系的建立

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1、HBV全基因组克隆转染细胞系的建立赵艳芳,闫永平,苏海霞,王安辉,张磊,张景霞,门可,徐德忠【关键词】肝炎病毒,乙型;基因组,病毒;克隆,分子;转染;细胞培养;基因表达【Abstract】AIM:ToconstructaneforproducingHBVinvitro.METHODS:FulllengthHBVDNAedpcDNA33HBV).HepG2cellsmunocytochemicalstaining.SgenemRNAexpressionidpcDNA33HBVainlyinthecytoplasm.Sge

2、nemRNAexpressionecanreach1×108copies/LdetectedbyrealtimequantitativePCR.CONCLUSION:RebinantplasmidpcDNA33HBVcouldbeexpressed,transcribedandreplicatedinHepG2cells.ThistransfectionbasedcellculturesystemcouldproducehighcopiesofHBVgenome.【Keye,viral;cloning,moleculo

3、r;transfection;cellculture;geneexpression【摘要】目的:建立HBV体外细胞培养体系.方法:构建HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV,稳定转染HepG2细胞,G418筛选.ELISA检测细胞上清液HBsAg,HBeAg的表达,免疫组化检测细胞内HBcAg的表达,RTPCR检测细胞S基因mRNA的表达,PCR检测细胞上清液DNA.结果:成功构建了HBV全基因克隆质粒pcDNA33HBV,稳定转染HepG2后,培养上清HBsAg,HBeAg阳性,细胞内HBcAg呈核浆型分布,且以浆

4、型分布为主.RTPCR证实有HBVS基因mRNA的表达,上清中HBVS及前S基因阳性,荧光定量PCR检测显示培养上清中HBV滴度达1×108拷贝/L.结论:重组质粒pcDNA33HBV能在HepG2细胞中表达、转录、复制,该细胞培养体系能产生较高水平的HBV.【关键词】肝炎病毒,乙型;基因组,病毒;克隆,分子;转染;细胞培养;基因表达0引言由于HBV宿主范围窄、动物模型缺乏,体外组织培养也一直没有太大进展,且不能在体外人工培养,制约了对HBV的研究〔1〕.将HBVDNA转移至靶细胞,建立表达HBV的体外培养细胞模型对研

5、究HBV生物学特性和肝炎发病机制有重要意义〔2-4〕.HBV基因组呈双链闭合环状,基因结构紧凑,其开放读框分布于全长DNA,为使完整的转染基因能在细胞内复制,目的基因的长度要大于一个HBVDNA单元〔5-6〕.我们构建3倍HBV基因的重组真核表达质粒,转染细胞,以筛选获得稳定表达病毒蛋白的细胞模型,并研究其产生HBV的水平.1材料和方法1.1材料HBV全基因亚克隆载体pUC193HBV为pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位点中插入头尾相连的HBV(adr亚型)三连体,由山东大学医学院免疫学研究所张秋博士惠赠,保存在大肠

6、杆菌DH5α中.真核细胞表达载体pcDNA3由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室赵晶博士惠赠;人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)由第四军医大学微生物学教研室惠赠,本室传代培养;内切酶EcoRⅠ,HindⅢ,T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶,反转录酶及DNAmarker(TakaRa公司);质粒提取试剂盒(西安市莱博科技发展有限公司);LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);DMEM培养基,G418(Gibco公司);新生小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司);ELISA检测试剂盒(上海

7、科华生物工程股份有限公司);SABC免疫组化试剂盒,DAB染色剂(武汉博士德生物工程有限公司);S基因,βactin及HBV前S/S基因引物均由北京赛百胜公司合成.1.2方法1.2.1pUC193HBV和pcDNA3的酶切鉴定及目的基因片段的获得过夜培养pUC193HBV和pcDNA3,以质粒提取试剂盒抽提制备pUC193HBV和pcDNA3,分别以EcoRⅠ,HindⅢ单酶切pUC193HBV,以EcoRⅠ,HindⅢ双酶切pUC193HBV和pcDNA3,琼脂糖凝胶电泳分离目的基因,利用胶回收试剂盒回收9600bp

8、HBV全长基因片段和线性pcDNA3.1.2.2pcDNA33HBV重组质粒的构建及鉴定HBVDNA与线性pcDNA3以浓度比3∶1混合,在T4DNA连接酶作用下4℃连接16h.连接产物转化感受态细胞DH5α.随机调取抗性菌落,经小量扩增,提取质粒,分别以EcoRⅠ,HindⅢ单酶切并以二者双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京三博远

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