药理学实验总结

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1、流式细胞术背景：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞屮，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸又脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表而的PS从Ku将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程屮丼不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转

2、到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS外翻发生在细胞核破裂，DNA片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。检测原理：用标记了FITC的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程屮也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合AnnexinV-FITC。正常细胞核早期凋亡的细胞膜是完整的，Propidiumiodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细

3、胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同吋与AnnexinV-FFTC和PI结合显色，而PI则被排除在活细胞(FITC阴性)和早期凋亡细胞(FITC阳性)之外。在没冇巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限妞示活细胞，为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FFTC+/PI+

4、);而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)O样品染色：1、离心收集悬浮细胞，弃培养基。贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心(300g*8min),收集细胞。胰酶消化时问不宜过长，以防引起假阳性。2、用冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸尽PBS。3、用400ul(200ul)lxAnnexinV结合液悬浮细胞，浓度大约lxl0*6cells/ml。4、在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8度避光条件下孵育15分钟。5、加入lOulPI染色液后轻轻混匀于2-8度避光

5、条件下孵育5分钟。6、立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。注意事项：1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。2、细胞处理要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。3、AnnexinV-FITC和Propidiumiodide(PI)是光敏物质，在操作吋请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的吋间。冇必要吋町以使用带盖+的冰盒或铝箔纸避光。4、由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。5、使用AnnexinV-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活

6、细胞。不需要阀定细胞，阀定操作会对结果产生干扰。6、如果细胞样品屮含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与AnnexinV结合。7、流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1x10*5。8、如果细胞收集过程巾使用了胰酶，需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解AnnexinV-FITC,最终导致染色失败。9、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞•合并染色；处理贴壁细胞时耍小心操作，尽量

7、避免人为的损伤细胞，胰酶的消化时间过短，细胞需要用力吹打XT能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过L<:,细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合。消化吋将肷酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉人部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA,EDTA影响AnnexinV与PS的结合。10、成功的检测凋亡受以下儿种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡吋PS翻

8、转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的吋间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对试验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。11、有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度极低，难以染色，此时不适合用AnnexinV方法检测凋亡。细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）样品预处理：动物组织：1、切取5-20mg的动物组织材料，在液氮屮将组织研磨成粉末，并转