凋亡蛋白抑制因子livin基因sirna表达载体

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1、凋亡蛋白抑制因子livin基因siRNA表达载体【摘要】目的：构建3个针对凋亡蛋白抑制因子livin基因mRNA的小干扰RNA(siRNA)表达载体，然后转染HCT-8/V细胞。为研究livin基因沉默对HCT-8/V细胞耐长春新碱特性的影响奠定基础。方法：合成3对靶基因livin的siRNA寡核苷酸序列通过退火生成转录模板，与线性pGCsi-H1/Neo/GFP质粒连接，转化DH5α钙化菌抽提重组质粒，测序鉴定。用脂质体2000将重组质粒转染HCT-8/V细胞并用G418筛选。结果：转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落，测序结

2、果与所设计、合成的livin的siRNA转录模板序列一致；在荧光显微镜下观察到HCT-8/V细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞。结论：成功构建livin基因的siRNA表达载体，转染并筛选出转染了livinsiRNA表达载体的HCT-8/V细胞。【关键词】小干扰核糖核酸质粒凋亡蛋白抑制因子转染[Abstract]Objective:Toconstruct3eukaryoticexpressionvectorsofshorthairpinRNA(shRNA)againstl

3、ivingeneandthentransfectintoHCT-8/Vcells,andtopavetheRNAsequencesplates,andthenlinkedidpGCsi-H1/Neo/GFPtogeneratesiRNAeukaryoticexpressionvectors.Plasmidsed.Theninsertsequencesplatesequencesaccordingtosequencing.ExpressionofgreenfluorescentproteinintransfectedHCT-8

4、/Vicroscopy.Conclusions:Therebinantvectorsallinterferingribonudeoacid;Plasmid;Inhibitorofapoptosisprotein;Transfection凋亡蛋白抑制因子livin是凋亡抑制蛋白家族成员之一，livin的过表达与肿瘤的发生、发展和肿瘤耐药[1]有关。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种高效的基因表达阻断技术,它通过体外合成或体内表达在靶细胞内产生与目的基因同源的含21~23个核苷酸的双链小分子干扰RNA片

5、段(smallinterferingRNAs,siRNA)。siRNA制备方法有多种，若在哺乳动物细胞内持久表达siRNA以期长久抑制靶基因，通常采用表达载体的方法。本研究拟构建3个livin基因siRNA表达载体,用此载体转染耐长春新碱的结肠癌细胞株HCT-8/V,为研究RNAi技术抑制livin在耐长春新碱结肠癌细胞株HCT-8/V中的表达，进一步探索livin的siRNA对逆转HCT-8/V细胞耐长春新碱的效果从而为研究肿瘤耐药的基因治疗提供物质基础和技术准备。1材料与方法1.1材料pGCsi-H1/Neo/GFP表达

6、载体与siRNA模板退火缓冲液（上海吉凯公司），T4DNA连接酶、内切酶BamHⅠ、HindⅢ（Promega公司）。PCR产物纯化试剂盒（上海华舜公司）。高纯质粒提取试剂盒（北京天根生化科技公司）。HCT-8/V耐长春新碱细胞株、胰酶、G418（南京凯基生物公司）。RPMI1640培养基、MEM培养基和胎牛血清（上海吉泰公司）。转染试剂Lipofectmine2000（Invitrogen公司），3对livinsiRNA转录模板序列由上海生工生物工程公司合成。1.2方法1.2.1siRNA转录模板的设计与合成Livin基因

7、转录产物因剪接方式不同有两种mRNA亚型Livinα和Livinβ，两者在第六外显子差54个碱基，因此以两者序列共同部分为模板，根据GenBank报道的livinmRNA序列(Livinα为BC014475，Livinβ为AF311388)用Ambion公司的siRNA在线软件设计，并根据siRNA设计原则[2]挑选3条发卡结构的siRNA序列模板，分别命名为siRNA-liv158，siRNA-liv625，siRNA-liv1234。经BLAST检索确认与livin以外的人类已知基因序列无同源性。3个靶序列和相应发卡结构

8、模板如下:（1）siRNA-liv158　靶序列为5’-AAAGACAGTGCCAAGTGCCTG-3′，其发卡结构模板为：（2）siRNA-liv625靶序列为5’-AAGAGACTTTGTCCACAGTGT-3’，其发卡结构模板为：（3）siRNA-liv1234靶序列为5’-AACT