根癌农杆菌介导的小麦抗白粉病基因转化及小麦小孢子培养研究

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1、山东大学硕士学位论文基因枪法是目前植物遗传转化的主要方法。该法适用范围广，技术成熟，操作简便(Klein等，1999；Patnaik等，2003)。二十世纪90年代初，由于单子叶植物农杆菌转化技术不成熟，基因枪法转化得到了很多成功的例子。1992年，Vasil等首次报道用基因枪轰击法转化小麦获得成功，他用幼胚产生的愈伤组织为受体，将抗除草剂基因bar和GUS报告基因转入小麦，得到了可育植株(Vasil等，1992)。1993年，Weeks等用基因枪法将bar和GUS基因转入小麦愈伤组织，得到了可育的转

2、基因植株，转化频率为O．1％～0．2％(Weeks等，1993)。1994年，Becker等和Nehra等分别用小麦离体盾片为受体，获得转bar基因植株，转化频率为O．5％～1．5％和1．1％(Becker等，1994：Nehra等，1994)。但基因枪法也存在明显缺点，即所涉及的仪器及材料比较昂贵、整合的外源基因拷贝数较多、整合位点较复杂、易造成转基因在后代中的沉默等(Xiao等，1998)。3．2．农杆菌介导法单子叶植物曾因不能分泌酚类化合物等原因，而被认为不能被农杆菌转化。1994年，Hiei等

3、通过向水稻组织创伤部位添加乙酰丁香酮，用农杆菌转化水稻获得成功(Hiei等，1994)。小麦的农杆菌转化，直到1997年ChengMin等利用农杆菌转化小麦未成熟胚来源的愈伤组织才得以突破，获得了可育的转基因植株，最高转化频率为4．3％。继之，1999年，Xia等利用农杆菌转化小麦胚性愈伤组织，获得转nptII基因的小麦，转化几率为5．9％。与其它方法相比，农杆菌转化法有明显的优点：整合的外源基因拷贝数比较低，通常1～2个拷贝；整合的外源基因发生重排和沉默的几率比基因枪轰击法低；多数情况下，整合的外源

4、基因有较明确的边界序列，通常是T-DNA左右边界序列(RepellinAM，2001)。基于农杆菌介导基因转化的以上优点，因此，尽管该方法有一定的基因型限制，但仍是目前小麦遗传转化的重要方法。二：反义RNA技术及其在植物基因工程中的应用1．反义RNA技术反义RNA是指与靶RNA(多为mRNA)具有互孝}序列的RNA分子，它是反义基因(antisensegene)或基因的反义链(antisensestrand)转录的产物(李祥等，山东大学硕士学位论文2003)。通常把转录产生反义RNA的基因称为反义基因

5、或反义DNA，(CottemM等，1989)。反义RNA与mRNA通过碱基配对形成较稳定的RNA--RNA二聚体，阻止mRNA的有效翻译，从而调控基因的表达。原核生物细胞中的反义作用：在原核生物中，不同反义RNA其功能和作用方式不尽相同，可以从复制、转录、翻译等三个水平上发挥作用(李祥等，2003)。在复制水平上，反义RNA可作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA前体互补结合，抑$IJDNA的复制，从而控制复制效率；在转录水平上，反义RNA可与mRNA5’末端互补而阻止RNA的转录：反义RNA更主要的

6、调控功能表现在翻译水平上，反义RJqA在转译水平上有三种作用方式：一是与mRNA5’端编码区包括SD序列的结合，直接抑制转译：二是与mRNA5’端编码区主要是起始密码子AUG结合抑制转译的蔗垦始；三是与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构象改变，影响其与核糖体结合，间接抑$IJmRNA的转译(OkamotoK，等1986)。真核生物细胞中的反义作用：一是对真核mRNA前体拼接的影响。真核生物基因表达的环节比原核生物复杂，绝大多数真核生物基因中含有内含子，它们在转录后的拼接过程中被去除。现已发现一

7、些真核的反义RNA分子直接影响拼接过程。反义RNA能跨越拼接位点与mRNA前体局部结合，及时地阻止了非编码序列形成环突状剪接体，阻止拼接的进行。也发现某些小分子反义RNA与真核RNA前体中内、含子共性的5’端拼接位点相互补，这种配对结合促进了mRNA对其所含的内含子的加工剪辑。二是影响mRNA前体的转移。真核mRNA前体是在细胞核中转录形成的，它们必须被转运到细胞质中才能被转译，发现某些反义RNA可与真核mRNA前体分子的5’端结合，阻挡了这种转移的发生，直接影响相应基因的表达。三是，影响真核mRNA

8、分子5’和3’端正常的修饰。大多数真核生物mRNA分子5’端要经过加帽反应，如带上甲基化G；3’端要经过加尾反应，接上多聚腺苷酸尾巴。加帽和加尾修饰使真核mRNA分子比原核mRNA分子更稳定，能抗RNA酶的降解作用，具有更长的分子寿命。前面所提及的影响转移，实际上同时也影响了加帽反应(李祥等，2003)。其它作用：反义RNA的作用机理被不断地揭示出来，还有人认为反义RNA会激活RNaseH，RNaseH专一性降解DNA—RNA杂合双链中的RNA，造成转录