成年大鼠心肌细胞分离方法

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1、成年大鼠心肌细胞分离方法【摘要】目的:探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法:分别应用酶消化法（0.1%的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察,结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果:用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70%～80%、杆状、横纹清晰。结论:三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。【关键词】大鼠;心肌细胞;细胞分离【ABSTRACT】Objective:Tostudythem

2、ethodsofisolatingadultratventricularcardiomyocytes.Methods:Themethodofenzymedigestion(0.1%trypsinand0.1%collagenasebyturns)ormechanicalmethod:mechanicalisolationafterprocedurecryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freezeandkeepunder-196℃)ormechanicalisolationafteralcoholandparaform

3、fixationusculartissuesandobtainsinglecardiomyocytesuspension.Thecardiomyocytesorphologicallyobservedicroscopeandevaluatedthroughtrypanbluedying.Results:Viabilityoffreshlyisolatedadultratventricularcardiomyocytes,yocytescanbeisolatedethods.【KEYEM(GIBCO)干粉,由双蒸去离子水配置液体]正压过滤除菌,pH7.2～7.4,-20

4、℃保存。1.1.3主要器材光学显微镜(Olympus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)1.1.4心肌细胞分离大鼠用25%乌拉坦（1.0g/kg）腹腔注射麻醉，取适量待测心肌组织（下列操作均除水浴和离心外均在超净工作台内进行）立即放入预冷的DHanks液中,冲洗3次。将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块,然后加入0.1%胰蛋白酶溶液10ml,37℃水浴8min后,吸取上层混悬液移弃。再加入0.1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后,吸取上层混悬液，放在预冷10%DMEM中终

5、止反应。剩余沉淀物再加0.1%胶原酶溶液15ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌30～40min后,吸取全部液体，终止反应。混悬液用200目孔径不锈钢网过滤除去未消化组织,在室温下800～1000转/min离心3～5min，弃上清，沉淀加入培养液2ml,混匀。1.2程序冷冻后机械法1.2.1动物同上。1.2.2试剂DMEM(GIBCO)，Ficoll(Pharmacia)，KrebsHenselEit缓冲液（mM）（NaCl118,KCl4.8,MgSO41.2，KH2PO41.2,NaHCO325,Glucose11，pH7.4），蒸馏水溶解后，经0.22μm滤膜抽

6、滤消毒，备用。0.1MPBS（mM）（NaCl138,KCl2.7,KH2PO41.2,Na2PO48.1，pH7.4）,蒸馏水溶解后，高压蒸汽消毒，备用。1.2.3主要仪器FA21045N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司),B600型离心机（白洋离心机厂），光学显微镜（Olympus）等。1.2.4心肌细胞的分离大鼠麻醉后，开胸迅速取心脏，将待测部分左心室放在60%甘油的DMEM的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）。从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻。用DMEM清洗心脏

7、，将左心室剪碎成1mm3的小块，于KH液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复一次。将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800转/min离心5min，0.1MPBS清洗两次，800转/min离心。将沉淀轻轻加入4%的Ficoll上，400转/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状心肌细胞。1.3酒精和多聚甲醛固定后机械法1.3.1动物同上。1.3.2主要仪器100目、300目筛子，眼科剪刀，眼科镊子，平皿，离心机等。1.3.3单细胞悬液的制备将待测心肌组织用生理盐水冲洗后置于70%酒精和4%多聚甲醛溶液(0.1MpH7.4)固定，4