从不育男性精液中磁性筛选非凋亡精子的初步研究

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1、万方数据activatedcellsorting，MACS)技术，后来MACS逐渐用于男性不育症患者的精子优选中，填补了精子优选技术在分子水平上的空白。MACS技术基本原理是在微磁珠表面绑定一种抗体，而这种抗体能与细胞表面的物质结合，这种结合了磁珠的物质一旦进去磁场，就会与其他未被结合的物质分离，从而达到阳性或阴性选择细胞的目的18-91。这种新型的MACS技术是基于分子水平的精予优选方法，能有目的地去除具有凋亡特点的精子。凋亡是细胞的程序性死亡，是人体细胞的一种止常的生理反应，精子的凋亡是精子发生成熟过程中重要的特征之一，而自发的凋亡对维持精子的止常数量是非常重要的“¨。精

2、子凋亡不仅发生在睾丸的生精时期，而且在精子形成后期也仍然会发生，而诱发过量的精子凋亡是一种异常的病理现象，过量的精子凋亡与男性不育密切相关u¨。凋亡导致精子细胞膜和DNA的完整性破坏，严重影响了精子功能。精子凋亡具有典型的特点，如caspase-3的激活，DNA断裂，线粒体膜电位的下降，质膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻nP¨1等。在精子的发生时期，具有凋亡的这些特点可被Sertoli细胞识别，特别是在PS外翻时，能被Sertoli细胞牢牢粘附进而最后分解消灭。射出的精子出现凋亡可能是凋亡精子逃脱了Sertoli细胞的吞噬。PS的是丝氨酸以酯键

3、与磷脂酸的磷酸基相连的一种磷脂，带负电荷。在体细胞凋亡时PS转移到细胞膜的外面，而正常时存在于细胞膜的内面n柏。膜联蛋白V是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，对凋亡时细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻具有高度亲和性“¨，可以作为一种灵敏的检测早期凋亡细胞的特异性探针n¨。外翻的PS与膜联蛋白V(annexinV)这种特异性结合也可以用于去除凋亡的精子。MACS系统主要由MACS磁珠、MACS分选柱和MACS分选器组成，该技术是一种方便、快速、简单的基于细胞表面标志物的分选方法“胡。该技术是利用藕联有annexinV的超顺磁珠与PS外翻的精子免疫性结合，这种被结合的精子和未被结合的精子通过一定

4、磁场力的作用下，结合的精子上的磁珠能被吸附在分选柱上，而未被结合的非凋亡精子则顺利流下来，最后脱离磁场后结合磁珠的凋亡精子在培养液洗涤之后会流下。因此通过此法可以有效地把凋亡精子和未凋亡精子分离出来。精子核DNA和细胞膜的完整性与精子功能和男性不育密切相关。导致精子DNA完整性破蝴i的因素很多，机制复杂。凋亡是导致精子DNA损害的原因之一。MACS技术是一种基于细胞膜表面PS外翻特点的新型的精子优选方法，质量越差的精液样本精子凋亡率就越高，其中annexinV+的精子就越多，因此检测这种新型的精子优选技术能否用于男性不育症患者中严重质量差的精液，从而优选精子凋亡率低和DNA完

5、整性好的精子对于提高辅助生殖的临床结局是具有重要意义7万方数据温州医科大学硕士学位论文的尝试。本研究中选取30例严重少精症的男性不育症患者，精液样本分别进行MACS和DGC处理，然后对优选后的精子进行活性caspase-3检测和TUNEL分析计算凋亡率，评价MACS技术对不育症男性凋亡精子的优选作用。8万方数据温州医科大学硕士学位论文材料和方法一、实验设计：研究对象为2011年12月-2012年6月期间温州医科大学附属第一医院生殖中心就诊的不育症男性患者30例，患者婚后同居1年以上，在未采取任何避孕措施及性生活正常的情况下不育。经体检未发现患者具有明显的睾丸、附睾、输精管等异

6、常，并排除家族史、性病史、性功能障碍等。选取的患者先禁欲3—7天，参照世界卫生组织(worldhealthorganization，WHO)制定少精症的标准，精液密度需<20×106／ml，射出的精液收集后置于37℃水浴箱中液化，时间15—30分钟，在精液液化后用Malker技术板分析精子的密度和活动度，然后将液化的精液分成三份，一份做control组行空白对照，另外两份分别行MACS处理和DGC处理。然后这三份精液分别用FLICA技术检测活性的caspase一3，用TUNE分析DNA断裂情况，在荧光显微镜下根据显色反应分别计算其阳性率，实验流程图如下：二、实验对象随机选取2

7、011年12月-2012年6月期间温州医科大学附属第一医院生殖中心不育症男性患者20例，参照世界卫生组织(WHO)的少精子症标准，选取严重少精症的男性精液，其密度在5-10×106／ml之间。患者婚后同居1年以上，在未采取任何避孕措施及性生活止常的情况下不育。经体检未发现患者具有明显的睾丸、附睾、输精管等异常，并排除家族史、性病史、性功能障碍等。二、试剂9万方数据温州医科大学硕士学位论文1、Pureception分层液：CooperSurgica，美国2、磷酸盐缓冲液(PBS)：北京中杉金桥生物科技公司