mage-a3慢病毒载体感染树突状细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用

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1、中文摘要目的采用基因克隆技术构建MAGE-A3慢病毒过表达载体，感染人脐带血诱导培养的DC，检测其对MAGE-A3阳性表达的肿瘤细胞株的杀伤作用，探讨MAGE-A3基因修饰的DC介导的抗肿瘤效应。方法1.收集足月健康产妇脐带血，利用明胶沉淀红细胞，人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，并用细胞因子（rhIL-4、rhGM-CSF）诱导单个核细胞分化为DC，通过倒置显微镜、常规切片和电镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面分子，混合淋巴细胞反应检测DC的功能，综合鉴定诱导的DC。2.应用基因克隆技术，RT-PCR扩增MAGE-A3基因全长cDNA序列，与慢病毒载体pGC-FU连接，

2、构建MAGE-A3基因的慢病毒表达载体，通过PCR和基因测序鉴定。并进行滴度测定。3.将构建的MAGE-A3慢病毒载体感染未成熟DC，肿瘤坏死因子（rhTNF-α）诱导DC成熟，倒置荧光显微镜观察病毒感染效率，RT-PCR和Westernblot检测MAGE-A3基因/蛋白的表达。筛选MAGE-A3阳性表达的人肿瘤细胞株，经修饰的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CytotoxicTlymphocyte,CTL）的扩增，用乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）法检测特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用。结果1.联合应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4

3、及TNF-α从人脐带血中成功培养获得较多量的DC。DC形态不规则，细胞表面可见细小的突起；流式结果显示，未成熟DC(imDC)低表达细胞表面分子CD83、CD86、HLA-DR，成熟DC(mDC)上述细胞表面分子明显增高，CD83、CD86和HLA-DR分别达到55.21%、69.12%和93.53%；混合淋巴细胞反应结果显示，mDC较imDC对淋巴细胞的增殖刺激作用明显增强(P<0.05)。2.成功构建MAGE-A3慢病毒表达载体。琼脂糖凝胶电泳显示，重组慢病毒表达载体PCR扩增获得大小为988bp的片段，与需构建的MAGE-A3大小相符；经测序鉴定显示，测序结果与目标序列

4、完全一致。MAGE-A3慢病毒载体滴28度为2×10TU/ml。3.MAGE-A3慢病毒载体成功感染人脐带血来源的DC。倒置荧光显微镜观察，MAGE-A3慢病毒载体感染DC效率较高，感染12h即可见荧光表达，感染效率可达60%；提取感染后DC的mRNA及蛋白，RT-PCR和Westernblot可检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达；筛选出MAGE-A3阳性表达的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HUH-7；诱导后的CTL对SGC-7901和HUH-7的杀伤率达到（59.98±4.83）%和（70.1±14.4）%，明显高于对照组，差异有显著性意义(P<0.05)。结论1

5、.成功培养人脐带血DC，并优化大量获得DC的条件和鉴定方法。2.成功构建MAGE-A3慢病毒表达载体，获得较高滴度的慢病毒载体。3.经MAGE-A3慢病毒表达载体感染的DC在体外能够有效活化、扩增特异性CTL，对MAGE-A3阳性表达的肿瘤细胞株有较强的杀伤作用。4.本实验通过在体外观察MAGE-A3修饰的DC对肿瘤细胞的杀伤作用，对进一步的肿瘤免疫治疗研究奠定基础。关键词：树突状细胞；MAGE-A3基因；肿瘤；慢病毒载体；免疫治疗3Studyonthespecificantineoplasticimmunologicaleffectofdendriticcellinfect

6、edbyMAGE-A3lentivirusvectorinvitroAbstractObjective:ToconstructMAGE-A3lentivirusvectoranduseittoinfectDCwhichwegetitfromumbilicalcordblood.AfterthatwedetectthekillingeffectofDCtoMAGE-A3positivetumorcelllinesandtodetecttheAnti-tumoreffectofDCmodifiedbyCTA.Methods:1.Collectedthecordbloodfromf

7、ull-termhealthypuerperal,usegelatintoprecipitateredbloodcells,andculturedthemwithcytokinesrhIL-4,rhGM-CSF.ThephenotypeoftheseDCswasanalyzedwithmorphologicalassessmentstructureobservingandflowcytometricanalysis;ThefunctionalpropertiesoftheseDCswereidentif