胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和erk表达的影响

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1、胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞增殖和ERK表达的影响作者：姜志茹，龚均，张珍妮，曾文斌【关键词】胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类　　InfluenceofbileacidonproliferationandERKexpressioninhumannormalesophagealepithelialcells　　【Abstract】AIM:Toobservetheinfluenceofbileacidoncellproliferationandtheexpressionofextracellularsignalregula

2、tedprotEinkinase(ERK)inhumannormalesophagealepithelialcellsinvitro.METHODS:Humannormalesophagealepithelialcellsculturedinvitroediacontaining6differentkindsofbileacids(250μmol/L)respectivelyfor360min,inparisonalmediaetry.TheexpressionofphosphorylatedERK1/2protEIninedbytheimm

3、unoblottingtechnique.RESULTS:Bileacidexposed(312min)esophagealepithelialcellsexhibitedasignificantincreaseinproliferation,especiallyinSphaseofthecellcycle,andthelevelofphosphorylatedERK1/2protein.TT法和流式细胞技术测定细胞增殖状态.免疫印迹法测定磷酸化ERK1/2蛋白表达.结果：胆酸的短时间（3~12min）作用使细胞增殖比大于1，S期细胞比率升高

4、，磷酸化ERK1/2蛋白表达增加.当作用时间大于20min时，细胞增殖比和S期细胞比率下降.结论：胆酸的短时间作用可促进人正常食管细胞的增殖，与ERK表达上调有关.　　【关键词】胆酸；食管/细胞学；细胞增殖；细胞外信号调节MAP激酶类　　0引言　　近年来随着国内外食管反流性疾病的增加，对十二指肠胃食管反流的研究日渐深入.反流物中的胆汁主要由胆酸组成，胆酸在反流性食管炎、Barrett食管以及食管腺癌的发生发展过程中起着重要作用［1］.目前胆酸对食管细胞作用的信号传导机制研究尚少.丝裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedprotei

5、nkinase,MAPK)是细胞内信号转导的重要信号分子，细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase,ERK)是MAPK通路的主要途径之一，与细胞的增殖凋亡有关［2］.为了进一步探讨胆汁反流的致病机制，本文首次研究了胆酸对人正常食管黏膜上皮细胞的增殖和ERK表达的影响.　　1材料和方法　　1.1材料人角朊细胞培养液KSFM（keratinocyteserumfreemedium）及牛垂体提取物（BPE）,重组表皮生长因子（rEGF）（Gibco公司）.甘氨胆酸钠(GC),甘氨鹅脱

6、氧胆酸钠(GCDC),牛磺胆酸钠(TC),牛磺鹅脱氧胆酸钠(TCDC),胆酸(CA)及脱氧胆酸(DCA)（Sigma公司），分别溶于KSFM制成250μmol/L的胆酸溶液.抗人细胞角蛋白14单克隆抗体（CK14）（上海长岛生物有限公司）.抗磷酸化ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体（美国CST公司）.RIPA细胞裂解试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）.BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒（美国Pierce公司）.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养、鉴定和分组取材于食管癌手术切除的正常食管黏膜组织，进行病理检验，仅选取病理诊断正常的标本进

7、行细胞培养.标本获取经患者同意.标本采用无菌收集，保存于4℃无菌KSFM，4h内进行原代细胞培养，具体操作参照已有的方法［3］.获取的食管上皮细胞于KSFM（无血清培养液，含有BPE和rEGF）中，在37℃,50mL/LCO2条件下培养.第1次传代培养后进行CK14的免疫细胞化学染色鉴定细胞.实验组细胞于无BPE和rEGF的KSFM中同步化培养48h后，分别在6种胆酸溶液中培养3~60min.以正常培养液中培养的细胞为对照组.　　1.2.2细胞增殖分析将细胞接种于96孔板，5×103细胞/孔.胆酸作用结束后以正常培养液继续培养24h,MTT法

8、检测细胞增殖情况.在每孔培养液中直接加入10μLMTT溶液(5mg/mL)，4h后弃去培养液，用100μL二甲基亚砜裂解细胞.于490nm测定吸光值，计算细胞增殖比