抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

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1、抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选作者：林月霞董斌袁茵段涛田素娟【摘要】目的获得稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法以CAPHSBSA免疫BALB/c小鼠，用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞，体内诱生腹水法大量制备单抗。捕获ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型，间接ELISA法测定腹水效价；用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法来纯化腹水。结果成功建立了一株分泌抗CAP单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞4D10。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目90～110条

2、,间接ELISA检测诱生小鼠腹水的抗体效价达1∶2.56×105，纯度达95%，该细胞连续培养生物学性状稳定。结论成功制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、纯度高，为利用该单抗研制检测氯霉素残留试剂盒提供原材料。【关键词】氯霉素；细胞融合；单克隆抗体；间接ELISA　　Abstract:ObjectiveToacquirestableandsecretorymonoclonalantibodiesagainstchloramphenicolhybridomacelllines.MethodsBALB/cmi

3、cemunizedalinessecretingmonoclonalantibodyagainstchloramphenicol(CAPMcAb)munologicaltitersofCAPMcAbined.CaptureELISAmethodineisotypesofthemousemonoclonalantibodyandtheindirectELISAmethodedtodeterminethetitersofMcAbs.TmoniumsulfateprecipitationandprotEinGaff

4、initychromatographyprotEInpurificationmethodsacelllinesecretingCAPMcAb4D10phenicolMcAb4D10preparedhadhightiterandhighpurity,anditcouldbeusedtodevelopCAPimmunoassaykitfordetectionofCAPresidues.　　Keyphenicol；cellfusion；monoclonalantibody；indirectELISA　　氯霉素﹙ch

5、loramphenicol，CAP﹚一种人工合成的广谱抗生素，因其效价高，价格低廉而广泛用于畜牧业，成为畜禽疾病防治的重要药物。但氯霉素在肉、蛋、奶中即使是微量的残留也会对人类的健康造成直接或潜在的威胁，如能抑制人体骨髓造血功能、引起人再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿和早产儿灰色综合征等疾病［1］。因此氯霉素残留问题已经引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视。美国最早规定不允许在家禽饲养中使用CAP,出售的家禽必须做CAP残留检测。在我国，2002年农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残

6、留限量》中明确规定氯霉素禁止使用，在动物性食品中不得检出。所以，建立检测动物源性食品中氯霉素残留的分析方法具有重要意义［2］。　　到目前为止，国内外用于氯霉素残留检测的方法已近十几种，其中主要有微生物法、仪器分析法和免疫分析法［3］。免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应具有很高的选择性和灵敏性，因此，免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。目前使用最普遍的酶联免疫法(ELISA)，具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、

7、仪器化程度和分析成本低的优点，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一［1］。本实验拟采用杂交瘤技术制备并筛选出能稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为开发氯霉素ELISA试剂盒提供特异性材料。　　1材料与方法　　1.1材料BALB/c小鼠（雄性）购自广东省医学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（粤）20030002；昆明小鼠购自广州市白云区穗北实验动物养殖厂；免疫抗原CAPHSBSA，检测抗原CAPHSOVA由本实验室合成［4］。小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒为Sigma公司产品；Sp2/

8、0骨髓瘤细胞株购自中山大学实验动物中心细胞库。CAP、弗氏佐剂CFA、IFA、细胞培养基RPMI1640、HAT、HT为Gibco公司产品；酶标二抗羊抗鼠IgG为Santa进口分装产品。其他试剂均为国产、AR级试剂。　　1.2方法　　1.2.1动物免疫　　取8～10周龄雄性BALB/c小鼠，将CAPHSBSA与等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下注射，剂量为100μg/只，以后每隔2周加强免疫1次，