aavhtgfβ1基因体内转染羊椎间盘对髓核细

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1、AAVhTGFβ1基因体内转染羊椎间盘对髓核细【摘要】目的观察腺相关病毒(AAV)介导人转化生长因子β1（hTGFβ1）基因体内转染羊椎间盘后，对其Ⅱ型胶原的影响。方法SPF级山羊8只，共取椎间盘32个，实验组、对照组各16个。实验组椎间盘显微注射AAVhTGFβ1，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。术后4周对山羊腰椎间盘行免疫组织化学观察，采用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果实验组Ⅱ型胶原表达明显高于对照组，差异有统计学意义（t=3.521,P＜0.05）。结论AAVhTGFβ1基因体内转染后

2、能提高椎间盘细胞Ⅱ型胶原的表达。【关键词】转化生长因子β胶原Ⅱ型椎间盘［ABSTRACT］ObjectiveToobservetheeffectofhTGFβ1encodinggenemediatedbyadenoassociatedvirus(AAV)onthecollagenⅡofthenucleuspulposuscellsofintervertebraldiscofgoat.MethodsThirtyteightgoatsol/LPBSinjection.Fourent,immunohistoche

3、mistrystainingandVIDASanalysisiquantitativelyanalyzetheexpressionofcollagenⅡ.ResultsTheexpressionofcollagenⅡingroupⅠinggrog/kg、氯胺酮10mg/kg及地西泮10mg肌肉注射，氯胺酮1～2mg/kg静脉缓慢推注给药。山羊取右侧卧位，经腹膜后入路暴露腰椎间盘，任意选相连的4个椎间盘，实验组对应髓核用显微注射器各注射AAVhTGFβ150μL，对照组对应髓核注射磷酸盐缓冲液（PBS，0.01

4、mol/L）50μL，在相应椎体的横突用金属线作标记，逐层缝合。动物术前及术后3d肌注青霉素160万单位，术后室内休养3d。第4周处死山羊,共得到椎间盘32个，实验组、对照组各16个。立即用40g/L的多聚甲醛固定1周，EDTA脱钙处理，石蜡包埋，切成6μm厚的切片。免疫组织化学染色后光学显微镜观察，VIDAS图像分析系统测定其阳性产物的平均吸光度值，用SPSS13.0统计软件进行统计分析。2结果实验组Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示，椎间盘髓核中央区出现阳性细胞，且阳性细胞数较多、染色较深。对照组Ⅱ型胶原免疫组化

5、染色结果显示，椎间盘髓核中央区出现阳性细胞，且阳性细胞数较少、染色较浅。实验组阳性细胞的平均吸光度值为0.702±0.150,对照组为0.507±0.163，两组比较差异有显著性（t=3.521，P＜0.01）。3讨论椎间盘单元是由软骨终板、髓核和纤维环三部分构成。其上下两端为软骨终板，有许多微孔，是髓核营养代谢重要通路；中央有富含水分的糖胺多糖构成髓核；周围有胶原纤维上下垂直交叉构成呈同心圆排列的纤维环。髓核是全身最大的无血管组织，其营养物质的吸收和代谢产物的排除主要依靠软骨终板通路和纤维环外周通路。椎间盘退

6、变是从椎间盘细胞开始的，随年龄增长髓核细胞凋亡不断增加，退变逐渐加重[4]。椎间盘退变的生物学治疗研究主要集中于3个方面，各有其局限性。细胞因子直接注射治疗，半衰期短，不能长期在体内发挥作用，需要多次局部注射；组织工程细胞移植治疗，难于获得大规模、具有再生活力的种子细胞是其关键性的限制因素[5]；载体介导的基因治疗，取决于安全高效载体的研究进展。正常情况下髓核几乎不含Ⅰ型胶原，主要为Ⅱ型胶原，占椎间盘胶原总量的40%，多呈任意排列，胶原纤维中间间隔有大量的蛋白多糖和水分；随着椎间盘的退化Ⅱ型胶原的表达呈下降趋势

7、，聚合型蛋白多糖水分降低。TGFβ是一种多功能的生长因子超家族,目前已发现TGFβ1～TGFβ5共5种异构体，TGFβ1具有多重生物学效应，能促进未分化和分化早期的软骨细胞增殖，并刺激Ⅱ型胶原核蛋白多糖的合成，是椎间盘退变基因治疗中最为常用的细胞因子之一。但由于蛋白的融合及灭活，外源性生长因子半衰期短，体内直接注射只起到短期的作用，常需反复大剂量使用，通过何种方法使生长因子持续高效发挥作用一直是基因治疗和组织工程学研究的关键问题。本实验采用AAVhTGFβ1基因体内转染羊椎间盘的髓核细胞，腺相关病毒是长为4.

8、7kb单链DNA基因组的人类微小病毒，在19号染色体上可以稳定结合治疗基因，可以感染分裂期和非分裂期的多种细胞。无病毒基因表达和延长的转基因表达是其被广泛研究的主要原因。本研究实验组椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的表达高于对照组，差异具有统计学意义，提示AAVhTGFβ1基因转染椎间盘髓核细胞的方法可以提高Ⅱ型胶原的表达，为TGFβ1基因在延缓椎间盘退变的进程中发挥积极作用提供了一定的理论依