小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告山东大学

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1、小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学掌握染色法鉴别细胞的也死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、棺物细胞从组织中取出，迕体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，丼且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无谢条件不，川胰蛋G酶消化或机械分散等

2、方法，将动物组织分散成甲.个细胞开始首次培养KJli单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋A酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1:2或其他比例转移到另一个界器屮扩人培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。商等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件K要研究单个细胞成某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养

3、的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗袞老和防治各种疾病的途径和机制，也吋以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其有利于人类健康长海的方叫发展。因此动物细胞体外培养技术足研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技木、基因工程等研究领域。细胞培养的意义:具冇其他生物技术无可比拟的优点：培养条件易改变和控制，便于单因了分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发竹等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。细胞培养的

4、局限性：在脱离机体杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件冇水的质fi、无歯环境，敁适温度、渗透止、气体条件、朵适PH、营养条件和培养难质等。2.细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和災光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差昇：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死细胞膜受损，其通透性增加。菽于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基

5、蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞若色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具冇选择透过性，死细胞因艽原生质的选择透过性已遭破坏，故与岛渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞

6、IA］的酯酶異有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放fli能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光：而死亡细胞内的酯酶闵失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵付细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的鉍化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的袞老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于

7、氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。1.血球计数板的使用血球计数板足一块特制的厚载玻片，载玻片上宥4条槽而构成3个平台。屮间的平台较宽，其屮间乂被一短横槽分隔成两半，毎个半边上血各杏一个方格网（如图3）。每个方格网共分9人格，其中间的一人格（又称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度冇两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个屮方格乂分成25个小方格；另一种是一个人方格分成25个中方格，而毎个中方格乂分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有-•个共同特点，即每个大方格都山400个小方格组成（阁4）。每个大方格边长

8、为lmm,则每一大方格的面积为1mm2,每个小方格的面积为1/400mm2,盖上盖玻片后,盖玻片与计数室底部之阆的高度为0.lnun，所以毎个计数室（大方格）的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为l/4000mm使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数虽，再