青春期龈炎下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因的调查

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1、青春期龈炎下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因的调查【关键词】龈炎牙周斑基因型牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶是一种由牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）产生和分泌的蛋白酶，它与持续的Pg感染、牙龈炎症、肿胀、出血倾向、龈沟液的产生及牙周组织破坏等病理过程密切相关，其中牙龈蛋白酶K(gingipainsk,Kgp)是最有潜能的纤维蛋白降解酶。曾有报道青春期龈炎下菌斑中的Pg具有相对的Kgp基因型，为评估青春期龈炎的P.gingivalis特异Kgp基因型的发生率，揭示其与牙周疾病严重程度间有无相关关系，从而为牙周疾病的预防提供信息，现做了以下调查分析。1

2、资料与方法1.1调查对象及分组病例选自中通化卫生学校的新生，年龄14～18岁。青春期龈炎的诊断依据：青春期个体，唇侧龈缘及牙周乳头肿胀，探诊易出血，牙龈指数（gingival　index,GI）≥1，但附着水平无改变。试验分两组，青春期龈炎组36例，牙龈健康组（GI＝0）36人，每组男女比例为1：1。入选标准：①全身系统性疾病；②近期3个月内未服用免疫制剂和抗生素；③无正畸及牙周治疗史④无吸烟史。所有调查究对象均之情同意。1.2牙周临床检查在采集菌斑之前，检查并记录每例被检查者上、下颌的第一磨牙与切牙（指数牙，同时也为菌斑采样牙）的GI、龈沟出血指数（sulcusbleedi

3、ngindex,SBI）及探诊深度(probedepth,PD)，分别取其平均值。1.3Pg分离培养和DNA提取对每例被检查者上下颌的第一恒磨牙与切牙，用无菌刮匙自信去除龈上菌斑后，棉卷隔湿，吹干，用龈下刮匙插入龈沟底采集龈下菌斑，将采集的菌斑混合，放入200μl厌氧装运夜中，室温下涡旋振荡器震荡30s分散菌斑。将分散的细菌溶液10倍梯度稀释。取100μl稀释液接种于5mg/L氯化血红素，10mg/L维生素K1和5%无菌脱纤维羊血的BHI培养基（Gibco,美国)，厌氧培养5～7d。根据菌落的形态特征和革兰氏染色结果，挑取可疑Pg分离培养3d。增菌后-70℃保存备检。酚-氯仿

4、抽提法提取细菌DNA。1.416SrRNAPCR法鉴定龈下菌斑中的Pg。1.5PCR法扩增编码KGP催化域的基因片段;引物序列及反应条件Beikler等设计，扩增片段长度为792bp，由上海生物工程有限公司合成。利用Abiprism310序列自动分析仪进行PCR产物测序，结果进行局部序列相似性检索（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）。1.6Kgp基因的检测（酶切电泳）酶切体系20μl，包括PCR产物15μl，限制性内切酶MseI（Neg/L溴化乙锭）上100V电泳40min，300nm紫外灯下观察并照相。以100bpDNAladder为相

5、对分子质量标准（大连宝生物公司）。根据PCR产物酶切后的长度变化读出基因。1.7统计学分析结果用SPSS11.5软件包进行分析。用秩相关检验分析Kgp的酶活性及表达强度与各牙周指数之间的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Kgp基因片段PCR产物的序列分析及酶切结果基因序列同源性为90%～97%，与P.gingivalisseI切点，点以后3个条带，长度分别为102、288、402bp，kgp-B型因为无MseI切点，只有1条带，长度792bp.DNA测序基因分型结果与酶电泳结果相同。2.2Kgp基因型的检测率P.gingivalis有毒株W83表现为Kgp-

6、A型，而无毒株ATCC33277表现为KGP-B型。青春期龈炎组36例之中有20例P.gingivalis阳性，牙龈健康组36人之中有9例P.gingivalis阳性。所有P.gingivalis阳性个体的龈下菌斑中均检测出Kgp基因型，kgp-A型在青春期龈炎组和青春期龈炎健康组P.gingivalis阳性个体中检出率分别为80.0%和22.2%，Kgp-B型在青春期龈炎组和青春期牙龈健康组的P.gingivalis阳性个体中检出率分别为20.0％和77.8%。均具有显著正相关关系，差异有统计学意义（P＜0.5）。2.3Kgp基因型与各牙周临床指数间的相关分析经序和检验，青

7、春期龈炎组P.gingivalis定值的个体中，各牙周临床指数与kgp基因型分布无相关性，差异无统计学意义（P＞0.5）。3讨论调查发现青春期口腔中适宜的环境，使P.gingivalis的定值更为稳定。P.gingivalis在儿童和成年人检出率相似，为一过性定值，牙周健康者中也可检测到P.gingivalis。本次分析结果表明，在青春期龈炎组P.gingivalis阳性个体中，Kgp-B型比Kgp-B型更常见，而在青春期牙龈健康组中，P.gingivalis型更常见。P.gingivalis有毒株W8