regⅳ基因在结直肠癌细胞系中的mrna表达及pcdna论文

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1、RegⅣ基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNA论文高峰，郑声琴，张宇伟，金月玲，田小强，黄培林［摘要］目的：探讨RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的表达水平，构建并转染pcDNARegⅣ重组质粒，为阐明RegⅣ基因在结直肠癌发生发展中的作用机制奠定基础。方法：采用RTPCR方法检测HT29、Caco2、SidpcDNARegⅣandtransfectitforfurtherstudyofRegⅣincolorectalcancercells.MethodsRegⅣobtainedfromcolorectalca

2、ncercellsbyRTPCRpcDNARegⅣeafteridentificationofPCR，restrictionenzymedigestingandDNAsequencing.ThecolorectalcancercellsselectedbyG418idhadRegⅣgeneedandthepcDNARegⅣhasbeenconstructedandtransfectedsuccessfully,akesRegⅣhighlyexpressedinRegⅣregeneratingLoVocell.Keyid;

3、geneexpression;genetransfectionRegⅣ是Reg家族中一个在结直肠腺瘤高表达的差异表达基因，它的高表达与腺瘤的形成、腺癌的发生有关［13］，并用反向NorthernBlot得到证实［4］。尤其在癌前病变（腺瘤、溃疡性结肠炎［5］）、结直肠腺瘤癌变区的高表达提示，它可能是一个消化系统癌微转移的有效生物标记物。目前RegⅣ基因在结直肠癌中的表达改变已逐渐被人们所关注，但RegⅣ在癌中的上调是一种癌发生的伴随现象还是一种肿瘤特异性的反应，或者只是组织损伤的敏感反应物还是在癌中起癌基因的作用等问题尚

4、未阐明。本实验通过检测RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的mRNA表达水平，然后将高表达RegⅣ的cDNA目的基因构建成重组质粒pcDNARegⅣ，转染［67］至低表达甚至不表达RegⅣ的结直肠癌细胞系中，为阐明RegⅣ在癌发生中的作用机制提供一个有效可靠的方法。1材料与方法1.1材料E.coliDH5α大肠杆菌为东南大学分子病理研究所保存；HT29、Sine2000为Invitrogen公司产品；DEPC购自南京凯基公司；Rnase、MarkerⅣ购自南京天为时代公司；RTPCR试剂盒、EcoR1、BamH1、T4连接

5、酶、PCRPurificationKit购自大连宝生物公司；100bpMark购自申能博彩公司；G418购自Gibco公司；无内毒素质粒中提试剂盒购自Promega公司。1．2方法1．2．1引物的设计与合成［6］根据GenebankRegⅣ基因cds序列（全长477bp）和pcDNA3.1/(-)质粒特点，按照酶切位点对侧翼序列的要求设计引物并附带相应的酶切位点：上游引物，5′CATGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG3′；下游引物，5′CGCGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAG3′

6、。另外，设计一对片段长度为270bp的βactin基因引物：上游引物，5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；下游引物，5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′。1．2．2RegⅣRTPCR扩增用Trizol提取4种结直肠癌细胞系的总RNA，然后进行逆转录合成cDNA，接着再按如下条件行PCR扩增：94℃2min;94℃30s、60℃30s、72℃1min，30个循环;最后72℃7min。1%琼脂糖电泳检测，然后用PCRPurificationKit纯化回收，定量备用。1．2．3pcDNARegⅣ载

7、体的构建将纯化的RegⅣ片段（496bp，含酶切位点）和质粒pcDNA3.1/（-）(5.4kb)分别按如下反应体系进行双酶切反应：RegⅣ12μl，pcDNA3.1/（-）12μl，10×Buffer4μl，EcoR11.5μl,BamH11.5μl,ddH2O21μl,然后置37℃水浴2h，行琼脂糖电泳后分别用PCRPurificationKit纯化回收。将酶切纯化回收后的RegⅣ片段和质粒pcDNA3.1/（-）分别按如下反应体系进行连接反应：10×Buffer1μl，T4连接酶1μl，pcDNA3.1/（-）3μ

8、l，RegⅣ5μl，16℃过夜，然后转化用CaCl2制备的新鲜感受态细菌DH5α。次日在含100μgml-1羧苄青的LB平板上挑取2个单菌落进行双酶切、PCR及采用PCR产物测序鉴定（PCR产物需用回收胶试剂盒纯化）。1．2．4pcDNARegⅣ转染LoVo细胞系重组质粒pcDNARegⅣ0.8μg置于50μlOpt