光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响

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1、光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响【摘要】目的：研究光气吸入染毒前后大鼠肺组织基因表达的差异，探讨光气肺损伤作用相关的基因谱.方法：提取正常对照组和光气染毒组肺组织的总RNA，并以此为模板制备荧光标记的cRNA靶物，经杂交、洗涤后，通过扫描荧光强度和计算机软件分析，寻找染毒前后上调和下调的差异表达基因.结果：在大鼠20500个靶基因中，初步筛选出801条差异表达基因，表达上调的有557条，下调的有254条.根据基因的生物学功能，差异表达基因被分为9类：G1自由基＼电子传递相关；G2应激炎症相关；G3物

2、质代谢相关；G4细胞增殖＼分化＼凋亡相关；G5基因表达调控相关；G6受体和信号转导相关；G7蛋白质修饰＼分解相关；G8细胞骨架＼运动相关；G9离子通道与物质转运相关等.结论：光气可以引起肺组织基因的多发性改变，其差异表达基因的功能分类为进一步探讨光气中毒发生、发展的机制和有效救治提供新的线索和思路.【关键词】光气；肺/损伤；寡核苷酸序列分析；基因表达　　光气（phosgene,COCl2）又称碳酰氯，属于高毒类窒息性毒剂，是合成化工产品的重要原料，广泛用于涂料、农药、塑料和纺织品等生产领域，由于挥发温度

3、低（8.2℃）、分散度高、反应快速，而被认为是具有高度潜在危险的恐怖武器［1-2］.光气的主要毒性作用是对呼吸系统的损害，引发肺水肿［3］，但其中毒机制截至目前尚未完全阐明，临床治疗亦无特效措施［4-5］.我们利用基因芯片技术，探讨光气染毒后大鼠肺组织基因表达谱的改变以及差异表达基因与肺损伤的关系，旨在从新的角度对光气中毒机制进行阐述.　　1材料和方法　　1.1材料　　SD大鼠10只，雌雄各半，体质量145g～170g,（第四军医大学实验动物中心）；TRIzolReagent（美国Invitrogen公

4、司）；cRNA扩增与标记试剂盒（Lifegen公司）；RNA纯化试剂盒（荷兰Qiagen公司）；芯片杂交试剂盒（美国Agilent公司）；杂交箱（美国UVP公司，HL2000型）；芯片扫描仪（美国Axon公司，4000B型）；凝胶成像系统（美国UVP公司，G800型）.　　1.2方法　　1.2.1样本准备　　将大鼠随机分为对照组和染毒组，每组5只.正常组未在光气中暴露，染毒组给予光气染毒（38mg/L，1min）.4h后分别将两组动物按20mg/Kg用10g/L戊巴比妥钠麻醉，充分暴露胸腔，左心房开放

5、后经右心室沿肺动脉注入无RNA酶的水对肺组织进行灌洗以尽量排尽血液，最后在肺的同一部位剪取肺组织，经TRIzol处理，迅速置于液氮中保存.　　1.2.2总RNA提取和cRNA扩增　　标记用RIzol试剂一步法抽提细胞总RNA，并用甲醛凝胶电泳，检测总RNA样本的质量；用紫外分光光度计，分别在260nm，280nm处检测cRNA的产量和纯度.用cRNA扩增与标记试剂盒对靶物进行Cy3或Cy5荧光标记，用RNA纯化试剂盒对标记靶物进行纯化，分别在550nm，650nm处检测Cy3和Cy5的荧光强度，以评估荧

6、光标记效率.　　1.2.3芯片杂交实验　　芯片探针长度60mer，共包括22575个样点，其中覆盖大鼠基因20500个，positivecontrol探针913个，negativecontrol探针162个，空白探针1000个.按照芯片杂交试剂盒提供的操作标准，将芯片和cRNA荧光标记靶物进行杂交.经洗涤后，室温500r/min离心10min，甩干芯片表面液体，取出后立即进行扫描.　　1.2.4荧光扫描和数据处理　　将清洗甩干的芯片置于Axon4000B型扫描仪中，用Genepix3.0软件进行图像扫描

7、，得到芯片杂交图谱，读取每个样点的原始荧光信号数据，并对读取的数据用Spotfire8.0软件进行分析，经归一化处理后，制作基因差异表达分析散点图.导出上调基因和下调基因列表.判断基因差异表达的标准：当R≥2时表示基因上调；R≤0.5时表示基因下调；当0.5　　1.2.5基因功能分类　　对符合基因差异上调或下调表达标准的单个基因，通过连接基因库权威网站：.ncbi.nlm.nih.gov和.geneoncology.org，进行基因功能比对和分类，制作光气染毒后肺组织的差异表达基因图谱.　　2结果　　2

8、.1总RNA提取质量　　RNA甲醛凝胶电泳显示，28s，18s两条带清晰完整，证实提取的RNA无降解（图1）.经紫外分光光度计分析，A260nm/A280nm值均为2.0，说明制备的RNA纯度较高，符合实验要求.　　2.2cRNA标记效率　　以效率大于8μmol/g视为标记有效，计算得荧光标记效率分别为9.81μmol/g和9.04μmol/g，符合参加杂交反应的条件.　　2.3芯片杂交结果　　2.3.1差异表达基因　　经对双色荧光标记杂交