腺病毒介导脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达论文

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1、腺病毒介导脑源性神经营养因子基因在培养的雪旺细胞中的表达论文【摘要】观察腺病毒介导人脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF）基因在培养的雪旺细胞（Schersechainreaction,RT-PCR）检测BDNFmRNA的表达，用免疫印迹技术（immunoblotassay,EM培养液继续培养3~5d，收集出现细胞病变效应（cytopathiceffect,CPE）的293细胞，在-80℃和37℃之间反复冻融3次，离心弃沉淀，病毒上清再经CsCl线性密度梯度超速离心纯化后收集分装于-80℃保存备用。Ad-BDNF的感

2、染滴度采用蚀斑形成试验测定。1.2.2SD大鼠源性SC的培养将7日龄SD乳鼠脱颈处死后，剪取双侧坐骨神经用含青霉素、链霉素（均为500kU/L）的PBS溶液浸洗、去除血污。神经组织加入2.5g/L胰蛋白酶、2g/LⅠ型胶原酶混合消化60min后终止，100目筛网过滤，收集滤液，1000r/min离心5min，沉淀加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮，采用双30min差速黏附法接种细胞，置于37℃，50mL/LCO2条件下培养。接种24h后向培养液中加入10-5mol/L/阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，24h后吸弃，更新培养液继续培养，以后3d更换1次培养液，

3、至细胞融合后以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。采用山羊抗S-100多克隆抗体免疫细胞化学进行鉴定。选用第3～4代的细胞用于实验。1.2.3Ad-BDNF感染SC取密度为5×108/L的SC悬液2mL接种到6孔板孔内，当细胞密度大于80%时，吸弃培养液，根据不同MOI计算所需的病毒量，取相应体积的Ad-BDNF液加入孔内，37℃，50mL/LCO2条件下感染SC，90min后吸弃，更换为正常培养液继续培养。1.2.4RT-PCR检测BDNFmRNA的表达以MOI分别为0（即未感染对照组）,50,.freelin离心10min，加入Trizol液0.1mL使细胞充分裂解后加入氯

4、仿0.02mL抽提，12000r/min离心15min，吸取上清加入异丙醇0.05mL，室温放置10min后12000r/min离心10min，沉淀加入750mL/L乙醇清洗混匀后，7500r/min离心5min，沉淀37℃烘干后溶于DEPC水20μL中，用A260/A280比值鉴定RNA纯度。在Invitrogen公司的ThermoScriptTMRT逆转录酶作用下，以Oligo(dT)20为引物，50℃反应1h，85℃反应30min，将RNA逆转录合成cDNA。取逆转录反应液2μL进行PCR扩增，BDNFcDNA特异性引物序列参照文献设计5，上游引物为5’-CACTC

5、TGACCCTGCCCGCCGAG-3’，下游引物为5’-GCATTTAGGTGACACTATAG-3’，产物长度为430bp。反应条件：94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环。取10μL扩增产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测，条带的光密度由凝胶成像仪分析。1.2.5OI分别为0，50，100，200，400的病毒量感染SC，感染后24h收集培养液上清。上清经低速离心去除分子质量小于3000u的蛋白，150g/LSDS-PAGE电泳后，蛋白经100V恒压，1h电转移至硝酸纤维素膜上，TBST洗膜后用30g/LBSA/PBS室温封闭2h，兔抗

6、BDNF多克隆抗体（1∶100）4℃孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记的羊抗兔IgG（1∶100）室温孵育3h，TBST洗膜后ECL化学发光法显影，条带的光密度由凝胶成像仪分析。1.2.6ELISA检测BDNF蛋白表达的时效性感染组以MOI为200的病毒量感染的SC，对照组为正常培养的同一代SC，分别在感染后3，6，9，12，15，18，21d收集培养液上清。收集到的上清保存于-80℃。检测步骤按照Promega公司的BDNF蛋白ELISA检测试剂盒说明书进行。全部数据采用SPSS12.0统计软件进行方差分析。2结果2.1Ad-BDNF的滴度测定Ad-BDNF的感染滴度

7、经蚀斑形成试验测定，病毒原液扩增、纯化后的感染滴度为8.16×1012pfu/L。2.2培养SC形态鉴定在倒置相差显微镜下可见，SD大鼠源性原代SC接种24h后多数细胞已贴壁、伸展；72h后生长良好，形成较多单克隆集落。原代SC经8～10d传代1次。SC的典型形态为长梭状，胞体细长，胞核不明显，胞膜折光性强；细胞间呈复层生长，胞体相互重叠，单克隆集落常呈索带状。S-100染色阳性细胞为SC，其胞体内出现棕黄色着色（以胞质为主,强阳性时胞核也会出现着色），细胞边界清楚，与镜下所见形态一致。2.3感染后SC中BDNFmRNA的表达