白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化

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1、白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化作者：陈要臻郭丁丁马逾英，陈雯，王晓东，唐琳【摘要】目的建立白芷扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物。方法以12份白芷为试材,对AFLP分析过程中包括提取DNA的方法、DNA的提取质量和浓度、MseⅠ/EcoRⅠ酶切反应时间等进行了研究，从64对引物中筛选适合白芷的引物。结果改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好，建立了一种适于白芷AFLP银染技术的优化体系：模板DNA的用量为400ng,酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ反应时间为4h，筛选出了7对适合白芷的引物。

2、以引物E+AGC/M+CAA构建的白芷种质资源的AFLP指纹图谱,扩增带多,多态性强。结论建立了适用于白芷的AFLP反应体系，并筛选出了适合白芷的引物，为今后利用AFLP标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供了标准化程序。【关键词】扩增片段长度多态性反应体系;白芷　　Abstract：ObjectiveToestablishanoptimizedAFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)analysissystemofAngelicadahuruica.MethodsTheoptimiz

3、edAFLPanalysissystemdifferenthabitatsafteraparativestudyoftheessentialfactorsethod.ResultsTheimprovedCTABconventionalmethodethod.TheresultsoftheanalysissystemshoplateDNAeofdigestsystemplificationshouldbedilutedto10times;4)sevenpairsofprimer(E+AGC/M+CAA,E+ACT/M+CAC,E+AG

4、C/M+CAC,E+AAC/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAC/M+CAG,E+ACC/M+CTC)64pairsbyscreeningrepeatedly.AndE+AGC/M+CAAcouldamplifymoreuniformandhighsharpbands.ConclusionOurstudyshoolecularmap,identificationandclassification.TheseresultsprovidefundamentalsforfurthermolecularstudiesofAngel

5、icadahuruicausingAFLPmarker.　　Key;Angelicadahuruica　　扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）技术作为一项分子标记技术，是1992年由荷兰Keygene公司科学家ZabeauMare和Vospieter发明并发展起来的一种选择扩增限制性酶切片段的方法［1］。AFLP是基于RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)和PCR(PolymeraseChainReaction)相结合的

6、DNA分析技术。这种方法是一种选择性扩增限制性片段的方法,它结合了RFLP和RAPD的优点,既具有前者的可靠性，又具有后者的方便性。现已被广泛应用于生物多样性、指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因克隆等诸多领域［2］。　　白芷Angelicadahurica为伞形科植物，是一种常用中药，性温，味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效。目前对白芷的研究主要集中在白芷的品质、化学成分、药理作用等方面，其种质资源多样性、亲缘关系等方面的研究也有一些报道［3，4］，但是运用AFLP技术对白芷基因组的研究还未见报道。因此本研究旨在建立一套适合

7、于白芷的AFLP实验体系，并筛选出多态性强的引物，为进一步研究白芷的遗传多样性、种间亲缘关系AFLP实验奠定基础。　　1材料与仪器　　1.1材料白芷，2007-04采自四川遂宁GAP基地白芷种质资源圃。材料原产地见表1。样品经成都中医药大学生药教研室马逾英教授鉴定。取新鲜叶片，用硅胶迅速干燥后带回实验室，储于-70℃冰箱保存。　　表1供试材料及来源（略）　　1.2试剂EcoRⅠ，MseⅠ，T4DNAligase，rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。MseI／EcoRI接头、MseI／EcoRI核心引物及

8、MseI／EcoRI选择性扩增引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。亲和硅烷、剥离硅烷等购于北京鼎国生物技术有限责任公司。甲叉双丙烯酰胺为瑞士进口分装。其他试剂均为国产分析纯。　　1.3仪器Bio-Rad(MC013208)PCR扩增