人tnfα重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达论文

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1、人TNFα重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达论文马贵亮毛伟征杨堃安岗岱震波【摘要】目的构建带有人TNFα基因的慢病毒载体，并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RTPCR)从PCDDNATNFα质粒中获得人TNFα基因，利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGCFUTNFα，在脂质体Lipofectamine2000介导下与结构质粒pHelper1.0和包膜质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验

2、组(pGCFUTNFα)、空载体对照组(pGCFUEGFP)及空白组(脐血间质干细胞)，分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后，采用RTPCR以及ELISA方法检测TNFα表达。结果所获TNFα基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGCFUTNFα经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功，收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L，感染脐血间质干细胞后RTPCR、ELISA检测3组细胞均有TNFα表达,其中实验组大量表达TNFα,与其余两组比较差异有显著性

3、(F=11.677、21.321.freelanTNFαgene,andobserveitsexpressioninhumanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells(UCBMSCS).MethodsHumanTNFαgeneerasechainreaction(RTPCR)fromPCDDNATNFαplasmid.TheTNFαgeneidpGCFUTNFαbyinfusiontechnique.The293TcellsidpGCFUTNFα,the

4、constructionplasmidHelper1.0andtheenvelopeplasmidHelper2.0ine2000toproducelentiviralparticles.HumanUCBMSCSentalgroup(pGCFUTNFα),mockgroup(pGCFUEGFP)andblankgroup(UCBMSCS),ptylentiviralparticlesandPBS,respectively.TheexpressionofTNFαididsoflentiviralvect

5、orsRNAandproteinlevels(F=11.677,21.321;P0.01).ConclusionLentiviralvectorcarryingTNFαgenehasbeensuccessfullyconstructed.TheinfectedhumanUCBMSCScanexpressTNFαprotein.TheresultsofpresentstudyprovidebasisforapplicationofUCBMSCSgenetransfertherapyinthetreatmento

6、fgastriccarcinoma.KEYEM细胞培养基(Gibco)中，置37℃、体积分数0.05的CO2饱和湿度的孵箱中培养。当细胞长到80%融合时，用2.5g/L胰酶消化,将脐血间质干细胞分3组接种于6孔板,实验组为带有TNFα基因慢病毒感染的脐血间质干细胞(pGCFUTNFα组),空载体对照组为未携带任何目的基因慢病毒感染的脐血间质干细胞(pGCFUEGFP)，空白组为未经感染的脐血间质干细胞,每孔细胞数为5×104个。待细胞融合度达到30%，换液加入2mL低糖DMEM培养液,10g/L的po

7、lybrene1μL,实验组加入感染复数(MOI值)为10的重组慢病毒10μL,空载体对照组加入空载慢病毒1μL，空白组加入PBS1μL，72h后观察荧光。②RTPCR检测:分别抽提3组细胞总RNA,加入GAPDH基因引物作为内参,同时加入TNFα基因引物行RTPCR反应以及灰度分析,检测各组脐血间质干细胞中TNFα基因mRNA表达情况。每组随机读取5次灰度分析数据,取二者比值平均值。③ELISA检测：收集3组上清行TNFα蛋白检测,按ELISA试剂盒说明书操作,检测不同浓度TNFα标准品及各组细胞上

8、清液在波长450nm处吸光度(A)值,根据A值计算各组上清液TNFα浓度。1.3统计学处理应用PPMS1.5统计学软件3进行数据处理，结果以±s表示，数据间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。2结果2.1慢病毒载体表达质粒pGCFUTNFα构建电泳结果示，748bp处有特异条带,与预计产物大小一致,表明已成功提取TNFα基因(图1);慢病毒载体酶切后琼脂糖凝胶