嗜酸氧化杆菌铁硫簇生物合成机制研究

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1、嗜酸氧化杆菌铁硫簇生物合成机制研究第一章绪论1.1生物冶金概述硫在氧化过程中化学形态的多样性，决定了元素硫及含硫化合物的生物化学氧化过程中，硫代谢底物作用酶的多样性和整个过程的复杂性[32，33]。而Aferrooxidans由于其独特的生理学特性(低pH值，高重金属离子的生长环境)使得其硫代谢途径格外复杂。目前相似亚铁氧化系统研究来说，关于硫氧化运行机制的研究则进展相对较慢。单质硫在酸性条件下极端疏水具有很强的化学惰性而不易被氧化，而在Aferrooxidans的作用下，元素硫能通过一系列的硫氧化酶的作用进行氧化分解并最终生成产物

2、硫酸。图1-4是一个基于A.ferrooxidans对元素硫的氧化过程的大致示意图[34]。首先细胞胞外的稳定的八硫烧环状体系的多聚硫S8必须经过A.ferrooxidans的有效吸附和活化成线状的硫醇基团再通过细胞外膜蛋白的转运进入细胞周质空间内进而被位于周质空间内的硫双加氧酶(Sulfurdioxygenase,简称SDO)氧化成SO;2,细胞周质中的S032_进而被亚硫酸-受体氧化还原酶(sulfite:acceptoroxidoreductase,简称SOR)氧化成SCV:82()32.可能经由硫代硫酸盐-辅酶Q氧化还原酶(

3、Thiosulfate:quinoneoxidoreductase，简称TQO)、硫代硫酸盐脱氧酶(Thiosulfatedehydrogenase)、硫代硫酸盐硫转移酶(Thiosulfatesulfurtransferase)、连四硫酸盐水解酶[38](Tetrathionatehydrolase)等氧化生成S042_。活化转运过程中同时产生少量HzS经硫化物-辅酶Q氧化还原酶(Sulfideiquinonereductase,简称SQR)以辅酶Q为电子受体氧化成多聚硫烧(-SnH),再经过3032_或S2032_途径最终氧化生

4、成S042_[39]。LochoATCC23270购自美国典型菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCenter),由本实验室保存。采用的pET28b是含T7高效启动子的表达载体，其长度为5368bp,自身带有一个N-端的组氨酸标签(HisTag)/凝血酶/以及一个可选的C-端的组氨酸标签，具有卡那霉素（Kanamycin)抗性基因。其质粒图谱见图2.1。由于传统培养大肠杆菌的LB培养基在富含营养元素的同时也存在大量的成分复杂金属离子，如铁、铜、锌等。因此我们选用一种新型细菌生长的M9培养基，在M9基本盐培养基中只含有

5、细胞生长的必须元素，在细菌生长和蛋白的表达过程中能人为的控制添加外源金属离子的用量和浓度，可以更准确的研究铁硫蛋白对不同金属的结合能力以及金属离子对铁硫蛋白体内合成铁硫族的影响。将提取的基因组DNA使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，恒压80V电泳30min。在紫外下观察条带。使用天根公司的TIANgelMidiPurificationKit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行基因组DNA凝胶纯化。第三章嗜酸氧化亚铁硫杆菌IscU的克隆表达..........393.1引言..........393.2材料与方法..........403.

6、2.1细菌的培养..........403.2.2pET28b-IscU表达载体的构建..........403.2.3IscU蛋白的表达..........403.2.4IscU蛋白的纯化..........413.2.5IscU蛋白结合铁的能力的测定..........423.2.6IscU上铁硫族组装的测定..........433.3结果与讨论..........433.4本章小结..........53第四章嗜酸氧化亚铁硫杆菌IscS..........554.1引言..........554.2材料与方法........

7、..554.3结果与讨论..........584.4本章小结..........68第五章嗜酸氧化亚铁硫杆菌IscA的克隆..........69结论本论文以生物冶金的模式菌株嗜酸氧化亚铁硫杆菌A.feirooxidansATCC23270为模板，以其ISC铁硫簇系统为研究对象，研究了在其能量代谢过程中的电子传递途径里起重要作用的铁硫簇的合成及转运机制。全文结论如下：克隆了嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC23270的操纵子中表达支架蛋白的IscU基因，并转入了高效T7启动子的pET28b表达质粒。成功地在大肠杆菌BL21(DE3沖表达了

8、IscU,并对蛋白诱导条件进行了优化，发现在IPTG诱导浓度为0.5mM，室温过夜诱导的条件下能得到较高水平重组IscU的表达，表达后的重组蛋白主要以可溶性的形式存在于上清中。应用饱和的蜜合型硫酸镇琼脂糖树脂柱对含组氨酸标签的IscU