成人成骨细胞体外培养论文

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1、成人成骨细胞体外培养论文.freell、O分泌量为(1.875±0.549)ng/ml，明显高于成纤维细胞(P＜0.01)。可检测到Ⅰ型胶原而无Ⅲ型胶原。结论：此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞.freell、链霉素100μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清，其余同培养液。使用25cm2培养瓶(NUNCLON’Denmark)。二、骨组织片消化取骨科手术中获得的无菌骨碎片’彻底去除骨膜及软组织；用无菌Hank′s液冲洗3次’剪碎至体积小于1mm3；Hank′s液多次冲洗至骨片发白’放入锥形瓶内’加入0.25%胰

2、蛋白酶(骨碎片10倍体积)’37℃水浴中消化(30min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中’置37℃CO2培养箱内2～3d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30min’上清液经尼龙网过滤后’离心10min(1000r/min)’去掉上清液’沉淀物用培养液打匀’接种于25cm2培养瓶内’重复3次’直至离心后无沉淀物为止。将消化后的骨片浸泡于培养液中’2～3d后’重复上述胰蛋白酶消化步骤’仍有细胞释放’根据所需细胞量’可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊’10h后即有贴壁细胞’72h后’细胞完全贴壁’可冲洗

3、、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞，消化后，以1×105/ml浓度接种于培养瓶中，每瓶4ml’5d后换低血清培养液6ml，24h后收集上清液，分装于5个离心管内，-18℃保存’用于检测。三、成骨细胞特征性鉴定以皮肤成纤维细胞作为对照，鉴定实验所得成骨细胞。1.形态学观察:除常规形态学观察外，采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素’使终浓度为50μg/ml’培养箱内培养1h’换新鲜培养液培养1h，经Hank′s液冲洗3次’乙醇梯度脱水’固定’Olympus-Vanox-T显微镜落射荧光观察。2.成骨细胞上清

4、液AKP检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-Nitrophenylphosphatedisodiumsalt’NPP’上海丽珠东风公司)比色法［2］’无色p-NPP与AKP在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-Nitrophenol’经405nm波长比色’测得OD值’换算成国际单位。3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用BGP放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测［3］。根据放射免疫竞争结合原理，125I标记O和样品所含O与O抗体竞争结合，使用分离剂使结合抗体沉淀，4℃离心后，γ计数器测定沉淀物cpm数，根据标准品曲线得到样品O含

5、量。4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性Nacl溶液顺序沉淀抽提［4］，SDS-PAGE垂直板还原电泳法［2］。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽［5］。电泳液为0.05MTris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8)；样品液为0.125MTris、15%甘油、2M尿素、2%SDS、0.001%溴酚兰；染色液为0.25%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇和10%HAC；脱色液为5%异丙醇和8%HAC。样品解冻后’放55℃水浴中变性1h’加入样品缓冲液50μl’每个样品点2孔’每

6、孔加样20μl’另加Ⅰ、Ⅲ型胶原标准品’50mA恒定电流电泳1h后’每个样品第1孔内加入100μl20%β巯基乙醇(β-mercaptoethanol，Sigma)样品缓冲液’静置1h后’13mA恒定电流电泳12h’染色液染色1h’脱色液脱色24h’拍照片。四、统计方法使用Statpal软件包’对所得数据进行t检验。结果1．形态学观察：骨组织消化后所得细胞接种于培养瓶，10h后’开始有梭形贴壁细胞；72h后’细胞全部贴壁’并伸出生长突，可见细胞呈梭形或鳞片状生长’细胞表面分泌物较多；1周后’细胞开始呈现成骨细胞形态’多数呈鳞片形’

7、体积较大’多伪足’胞浆丰富’胞核较大’偏于一侧’有2～3个核仁［6，7］’一般2～4周至汇合；继续培养’可见局部多层生长’并有黑色结节生成。经四环素标记’荧光显微镜观察’为金黄色亮区’证实为骨结节。透射电镜下观察’培养细胞体积较大’长方形或方形，约40μm’胞浆丰富’内含大量粗面内质网，呈旺盛分泌相。2．成骨细胞上清中AKP检测：24h成骨细胞上清中，AKP分泌量为(2.76±0.56)U/ml，高于成纤维细胞分泌量(1.96±0.23)U/ml。两者相比，差异有显著性意义(P＜0.01)。3．成骨细胞上清中骨钙素检测：24h成骨

8、细胞上清中，O分泌量为(1.875±0.549)ng/ml，亦高于成纤维细胞分泌量(1.190±0.591)ng/ml，差异有显著性意义(P＜0.01)。4．胶原检测：成骨细胞有大量Ⅰ型胶原分泌’无Ⅲ型胶原分泌；成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原均有分泌。讨论